Survivin通过Wnt/β-catenin信号通路调控食管癌的侵袭和迁移的机制研究

孙光蕊，杨 阳，郑竞雄，赵宝山, 侯继申，梁宗英

(1.承德医学院附属医院胸外科，河北 承 德 067000 2.河北省胸科医院临床实验室，河北 石家庄 050000)

食管癌是世界范围内男性癌症相关死亡的第六大原因之一，其5年总体生存率约15%～25%[1]。食管癌治疗技术的提高在一定程度上改善了部分食管癌患者的预后，但其术后生存质量不尽人意[2]。食管癌细胞的无限制增殖和高侵袭性是术后患者复发及影响预后的主要原因，也是食管癌的临床治疗最大的挑战。Survivin是一种具有抗凋亡作用的小蛋白，其表达缺失可以引发多种疾病。与正常组织相比，它在肿瘤中大量表达，与许多人类肿瘤的不良预后有关。研究显示，Survivin可以调控肿瘤细胞的凋亡、细胞周期及血管的生成，在促进癌细胞存活和抑制细胞死亡方面具有重要作用[3,4]。既往研究证实食管癌的增殖、凋亡、迁移和侵袭与Survivin高表达密切相关[5]。但在食管癌中Survivin通过何种分子机制参与食管癌的发生尚未可知。本研究旨探讨在Survivin在食管癌中的表达及其促癌的潜在机制。

1 资料与方法

1.1临床资料：选取同一患者食管癌组织及癌旁组织55例，术前无任何治疗病史。男性：51例，女性：4例；≥60岁：48例，<60岁：7例；I+Ⅱ期：18例，Ⅲ期：37例；高分化：13例，中低分化：42例；有淋巴结转移：44例，无淋巴结转移：11例。

1.2主要试剂和细胞:Survivin、wnt3α、β-catenin、CyclinD1和c-myc抗体抗体购于购于美国Abeam公司；相关实验试剂盒购于西宝生物科技(上海)股份有限公司；食管癌EC109细胞和正常食管黏膜上皮细胞HEEC购于中国医学科学院肿瘤细胞库。

1.3方 法

1.3.1免疫组化学(SP法):组织切片二甲苯脱蜡，3%甲醇-H2O2溶液及枸橼酸钠缓冲液加热处理组织切片。山羊血清封闭，一抗孵育后加入二抗。PBS处理后滴加链亲和素-过氧化物酶工作液。DBA显色后复染、封片。

1.3.2细胞培养及转染:实验分组：转染Survivin小干扰RNA食管癌EC109细胞为实验组(si-S)；未转染RNA食管癌EC109细胞为阴性对照组(si-N)；正常EC109细胞为空白对照组(NC)。取对数生长期细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞制成细胞悬液。计数细胞后，接种到6孔培养板中，每孔约1×105个，加入含10%胎牛血清的F12培养液，细胞孵育箱内常规培养。当每孔细胞密度达到80%进行转染。转染当日用无血清F12培养基洗涤细胞2次后，每孔加入1.5mL无血清的F12培养基，放入细胞孵育箱内继续饥饿培养4h后进行转染。用30μL 1×riboFECTTMCP Buffer(V1)稀释1.25μL 20μM siRNA 储存液(V2)，轻轻混匀，室温孵育5min；加入3μL riboFECTTMCP Reagent(V3)，轻轻吹打混匀，室温孵育15min；将riboFECTTMCP混合液加入到465.75μL细胞培养基(V4)中，使总体积达到500μL，轻轻混匀；将培养板置于37℃的CO2孵箱中培养48h后以荧光倒置显微镜观察转染效果。

1.3.3RT-qPCR实验:提取RNA，应用反转录试剂盒进行反转录，PCR试剂盒检测mRNA；PCR的反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30s；58℃退火60s(40个循环)。循环完毕后68℃延伸7min。溶解曲线参照仪器自动程序。

1.3.4Western blot：提取蛋白并测浓度；制备电泳蛋白上样液，行凝胶电泳。电泳后，转膜。加一抗4℃过夜。次日孵育二抗，重复洗膜后显影。

1.3.5MTT实验:单细胞悬液100μL接种于96孔板。常规培养至每孔细胞密度达到80%进行转染。12、24、48、72h后，每个时间点拿出一块板，每孔加入5mg/mL MTT液30μL，继续常规孵育4h。离心，弃上清。每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，80r/min水平摇床摇匀5～10min。

1.3.6划痕愈合实验:用1mL无菌移液枪头在细胞铺满板底的12孔板板面垂直划痕；弃培养液后洗去细胞碎片；加入无血清培养基，定时拍照。

1.3.7Transwell小室实验:取转染后铺满孔底的三组细胞，计数细胞。Matrigel胶提前融化为液态状态备用。50mg/L Matrigel 1∶8稀释液包被Transwell小室底部8μm孔径的聚碳酸脂微孔滤膜，37℃过夜聚合成胶。Transwell小室按顺序放入24孔板，无菌镊子取出小室，室外加入含15%血清F12培养基600μL。小室内加入200μL细胞悬液，培养液为不含血清的F12培养基，每组细胞重复6个样本。24孔板放入CO2孵育箱内常规培养48h。取出小室，PBS淋洗，擦去微孔膜内层细胞。多聚甲醛固定后结晶紫染色。PBS涮洗3次，每次更换液体；棉签擦干液体，显微镜下计数穿膜细胞数；每个小室随机计数10个视野。

1.4统计学分析:研究数据采用统计软件SPSS21.0分析；计量资料以均数±标准差表示；计数资料以率或构成比形式表示，进行χ2检验；单因素方差分析组间资料比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1Survivin在组织中的表达及临床意义:免疫组化结果显示，食管癌组织中Survivin呈现高表达状态，其阳性表达率为78.18%(43/55)，显著高于癌旁组织的25.45%(14/55)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。统计分析结果显示，食管癌组织中Survivin蛋白阳性表达与肿瘤分期、组织分化程度及淋巴结转移相关(P<0.05)，而与性别和年龄无相关性(P>0.05)。详见表1。

图1 食管癌和癌旁组织中Survivin蛋白表达量

表1 食管癌组织中Survivin阳性表达与临床

2.2Survivin在食管细胞系中的表达:Survivin在食管癌EC109细胞中呈高表达，而在正常食管黏膜上皮HEEC细胞中呈低表达，二者有统计学差异(P<0.05)。见图2。

图2 Survivin在人食管癌和正常食管黏膜上皮细胞中的表达

2.3Survivin小干扰RNA转染EC109细胞效果验证:合成的Survivin-siRNA含有cy3红色荧光标记标签，转染成功后荧光显微镜下可见细胞内荧光染色。见图3。Survivin mRNA和蛋白表达量结果显示，si-S组 mRNA和蛋白表达量明显低于si-N组及NC组，差异具有统计学差异。见图4。说明设计合成下调Survivin的RNA干扰序列有效。

图3 Survivin小干扰RNA转染EC109细胞荧光转染效果

图4 RNA干扰后Survivin mRNA和蛋白表达量变化

2.4下调Survivn对Wnt/β-catenin信号通路的影响:采用蛋白印迹法(Western Blot)研究参与Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白，结果显示，与对照组细胞相比，下调EC109细胞中的Survivin可以显著抑制c-myc、cyclinD1、β-catenin和wnt3α蛋白的表达。见图5。

图5 下调Survivin对Wnt/β-catenin通路中wnt3α、β-catenin、CyclinD1和c-myc蛋白表达水平的影响

2.5下调Survivn可抑制食管癌细胞的存活:MTT实验结果显示，si-S组在72h时对EC109的细胞抑制率可达(26.47±1.68)%，说明下调EC109细胞中的Survivin可以显著抑制EC109细胞的存活。见图6。

图6 下调Survivin对食管癌EC109细胞的抑制率

2.6下调Survivin抑制食管癌细胞迁移能力:划痕愈合实验显示，与si-N和NC组相比，si-S组中EC109细胞划痕愈合缓慢，迁移能力显著下降。见图7。

图7 下调Survivin对EC109细胞的迁移能力的影响

2.7下调Survivin抑制食管癌细胞侵袭能力:侵袭实验显示，食管癌EC109细胞中Survivin表达下调后，si-S组中EC109细胞穿膜数显著减少，侵袭能力显著下降。见图8。

图8 下调Survivin对食管癌EC109细胞侵袭能力的影响

3 讨 论

食管癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，其发病较隐匿，大部分患者确诊时已属中晚期，总体预后不佳[6]。目前食管癌的临床治疗主要以手术、放化疗为主，但这些治疗会出现手术并发症、贫血和多器官功能障碍综合征等副作用，尤其对晚期食管癌患者的治疗效果有限[7]。现代精准的分子及免疫靶向治疗为食管癌患者提供了新的希望，因此，识别和筛查相关因子为临床分子治疗提供靶点成为食管癌研究领域的新热点。

Survivin蛋白是一种凋亡抑制基因产物,在多种肿瘤中呈高表达状态，可以促进肿瘤血管生成、抗凋亡及参与肿瘤细胞周期,最终导致肿瘤细胞异常增殖[8,9]。课题组前期研究表明，Survivin蛋白在食管癌组织中呈现高表达状态，且其与食管癌TNM分期、组织分化程度和淋巴结转移密切相关[10,11]。本研究再次通过免疫组化证实Survivin在人食管癌组织中呈高表达状态，且癌组织中阳性表达率显著高于癌旁组织。统计分析结果显示，人食管癌组织中Survivin蛋白阳性表达与食管癌病理分期、组织分化程度和淋巴结转移相关，且癌组织的TNM分期越低、分化程度越差，Survivin蛋白的阳性率也越高，淋巴结转移组织中的Survivin蛋白的阳性率明显高于无淋巴结转移组织，其结果与国内其他研究者研究发现一致[5]。这也说明，Survivin与人食管癌的发生和发展具有密切的相关性，其高表达可能是促进食管癌恶性转化的重要因素。进一步通过体外实验检测Survivin蛋白在食管癌细胞系中的表达，结果显示食管癌EC109细胞中Survivin蛋白的表达量显著高于正常食管黏膜上皮HEEC细胞的表达，进一步提示Survivin的高表达可能是促进食管癌的发展的重要因素之一。

医学研究表明，在人体内的正常细胞信号转导通路被阻断后可以罹患多种疾病，其中包括多种恶性肿瘤。这些障碍可能会造成基因的变异，从而诱发肿瘤的发生。既往研究证实，Survivin可以参与PI3K/AKT、ERK、Wnt/β-catenin及mTOR等与肿瘤发生相关的信号传导通路。上皮间质转变是导致恶性肿瘤的侵袭及转移的生物学基础，而在多种信号通路中Wnt/β-catenin 信号通路的异常表达与上皮间质转化的关系最为密切。当Wnt/β-catenin信号通路异常激活时，多种因子可与β-catenin相互作用，使得β-catenin由胞质转移至核内，从而诱导细胞癌变[12]。秦燕子等研究显示，Wnt/β-catenin信号通路中的β-catenin基因沉默可以导致整个通路的信号传导障碍，进而抑制食管癌细胞中上皮间质转变，同时可以促进食管癌细胞的凋亡，增殖、侵袭及转移能力显著下降[13]。在Wnt/β-catenin通路过程中起到关键作用的基因分子主要包括wnt3α、cyclin D1、β-catenin和c-myc，也是预测肿瘤侵袭和转移的重要分子标志。wnt3α、cyclin D1、β-catenin和c-myc在组织中的异常表达均可以影响Wnt/β-catenin信号通路的传导，进一步调控肿瘤的增殖、侵袭和迁移。既往研究证实，Survivin 基因的高表达可以通过调控Wnt/ β-catenin信号通路而影响胃癌的增殖[14]，但在食管癌中Survivin是否可以影响Wnt/ β-catenin信号通路尚不可知。本研究设计合成Survivin的siRNA干扰序列并转染食管癌EC109细胞，RT-qPCR和Western blot实验证实Survivin mRNA和蛋白水平显著下降，达到下调预期效果。实验结果显示，食管癌EC109细胞中下调Survivin可以显著降低Wnt/β-catenin通路中wnt3α、β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白表达量。这说明在食管癌中Survivin可以影响Wnt/ β-catenin信号通路的传导，且沉默Survivin可以通过影响通路中的wnt3α、β-catenin等关键因子的表达进而抑制整个信号通路的传导。进一步通过实验检测细胞的生物学功能，结果显示，下调Survivin蛋白表达抑制Wnt/β-catenin信号通路后，食管癌细胞的存活能力下降，迁移和侵袭能力受到显著抑制。以上研究结果说明在食管癌细胞中抑制Survivin基因的表达可以通过阻断Wnt /β-catenin信号通路的传导而抑制细胞的存活、增殖和侵袭能力。

综上所述，在食管癌中Survivin可以阻断Wnt /β-catenin信号通路的传导，进而抑制食管癌细胞功能，但其促进食管癌发生发展的更深入的机制仍需进一步研究。