芫根对脓毒症小鼠认知功能障碍的保护作用及机制初探#

李仟 罗太富 冯梓琦 朱玲 万莉红△ 江舟

（1. 四川大学华西基础医学与法医学院基础医学2018 级，四川 成都 610041；2. 四川大学华西基础医学与法医学院基础医学2020 级，四川 成都 610041；3. 四川大学华西基础医学与法医学院基础医学2019级，四川 成都 610041；4. 四川大学华西基础医学与法医学院药理学教研室，四川 成都 610041；5. 国家卫生健康委员会时间生物学重点实验室（四川大学），四川 成都 610041）

脓毒症（Sepsis）是由细菌等病原微生物侵入机体引起的全身炎症反应综合征，常以弥漫性脑功能障碍为首发表现[1]。患者临床上主要表现为躁动、注意力下降、意识改变、睡眠节律紊乱、谵妄等，且患者可能存在长期的认知功能障碍，严重影响生活质量和自理能力[2]。因此明确发病机制，寻找诊断、治疗的新靶点刻不容缓。

缺氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是细胞和机体对缺氧稳态反应的重要调节因子，可通过激活多种基因的转录，参与包括能量代谢、血管生成、细胞凋亡等多种生命体活动[3,4]。研究表明，HIF-1α 在脓毒症引起的肺组织、心肌组织损伤中均明显上调[5,6]，可见在脓毒症发生发展中HIF-1α 发挥重要作用。目前认为在HIF-1α 的作用下，丙酮酸由进入三羧酸循环，转变为直接生成为乳酸，导致大量乳酸堆积进而激活炎症反应、补体系统等，最终引起组织的损伤和死亡[7]。活化的蛋白激酶C 受体1（Receptor for activated C kinase 1，RACK1）作为体内广泛表达的一种支架蛋白，具有调节细胞生长、自噬、免疫等多种重要作用[8]。目前研究表明，RACK1 作为HIF-1α 的负调控因子，可通过泛素化途径降解HIF-1α[9]。课题组前期研究发现，发生认知功能障碍的脓毒症小鼠同时出现脑葡萄糖代谢下降以及RACK1 表达降低，可见调控RACK1/HIF-1α 通路有可能成为耐缺氧药物的潜在靶点。

芫根是西藏道地食、药、饲三用植物，资源丰富。在藏医典籍《甘露本草明镜》、《四部医典》、《新编藏医学》等中均记载有，芫根具有耐缺氧、缓解疲劳、延缓衰老等功效。当地藏民常将其晒成干食用，以缓解头晕头痛等高原反应。前期研究发现，芫根提取液灌胃可明显降低小鼠血清乳酸水平，增加乳酸脱氢酶活性，同时影响HIF-1α的表达。本文拟从RACK1/HIF-1α 通路初步探究芫根对脓毒症小鼠认知功能的改善作用，为开发芫根药用价值提供初步的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

芫根提取液是阿坝州新鲜芫根交由四川小叶本草生物科技有限公司加工提取而成，LPS（Sigma，美国），生理盐水（科伦，中国），BCA蛋白质测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，中国上海），RACK1 鼠单克隆抗体（CST，美国，稀释比 1:1000），HIF-1α 兔单克隆抗体（Immunoway，美国，稀释比1:1000），β-Actin 鼠单克隆抗体（CST，美国，稀释比1:1000），辣根酶标记羊抗免IgG（中杉金桥，中国，稀释比1:10000），辣根酶标记羊抗小鼠IgG（中杉金桥，中国，稀释比1:10000），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore, Billerica, MA，USA）。

1.1.2 动物

SPF 级KM 雄性小鼠21 只，6-8 周龄，购自成都达硕实验动物有限公司（中国，成都），饲养于5 个独立送风隔离笼具中，光暗循环12:12，温度22℃、湿度55%。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分组与模型的建立

将21 只雄性KM 小鼠适应性喂养3 d 后，根据体重随机分为：对照组（n=4）：腹腔注射生理盐水，模型组（n=8）：生理盐水灌胃+腹腔注射LPS，治疗组（n=9）：芫根灌胃+腹腔注射LPS。所有小鼠按照分组连续灌胃给药，每日一次，每次灌胃量为20 mL·kg-1。灌胃结束后次日腹腔注射LPS 10 mg·kg-1建立脓毒症小鼠模型。

1.2.2 脑组织病理学HE 检测

连续灌胃给药7 d 后，模型组及治疗组各随机抽取4 只小鼠腹腔注射LPS 构建脓毒症小鼠模型，次日经戊巴比妥钠深度麻醉后取脑，置于4%多聚甲醛中固定48 h 后，依次等级脱水、石蜡包埋、苏木素-伊红（HE）染色。使用光学显微镜观察海马神经元形态变化。

1.2.3 旷场实验

剩余小鼠连续灌胃给药14 d 后，LPS 腹腔注射构建脓毒症模型。造模后第7 d 进行旷场实验。采用规格（100×100×40）cm 的旷场箱，平均分为25 份。将小鼠从中央区域放入旷场中心，记录300 s 内小鼠在中央、角落、四周区域的停留时间，以及总运动时间。中央区域停留时间越长，角落及四周停留时间越短，总运动时间越长说明小鼠抗焦虑能力越强。

1.2.4 蛋白提取及Western blotting

旷场实验结束后，经戊巴比妥钠深度麻醉小鼠取脑，每克组织加入5 mL 裂解液（RIPA :PMSF=100 : 1）匀浆后置于冰上裂解30 min，随后4°C、13000 g 离心10 min 收集上清，获得总蛋白。使用BCA 试剂盒（凯基生物公司）测定蛋白浓度；经电泳、转膜、封闭、4°C 一抗孵育过夜、洗膜、二抗室温孵育2 h、洗膜、曝光后，采用Quantity ONE 软件以β-actin 为内参进行半定量分析。

1.3 统计学分析

所有数据使用SPSS 21.0 软件进行统计学分析，计量资料以均值±标准差（±SD）表示，组别之间比较采用t检验（Student's t test）分析；P＜0.05 被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芫根对脓毒症小鼠认知功能障碍的改善作用

在旷场实验中，对照组小鼠运动轨迹分布较均一；模型组小鼠与对照组相比：角落区域的停留时间及总静止时间明显增加，中央区域及四周区域停留时间减少；而与模型组相比，芫根治疗组小鼠角落区域停留时间以及总静止时长明显减少（P＜0.05），四周区域、中央区域停留时间明显增加（P＜0.05），见图1。

2.2 芫根对脓毒症小鼠海马区神经元损伤的保护作用

HE 染色显示，对照组小鼠海马神经元细胞带致密、整齐、均匀，细胞形态结构正常；模型组小鼠海马神经元细胞层次欠清晰，细胞带宽度变窄，细胞排列松散紊乱，形态异常，大量神经元细胞变性、坏死，细胞结构遭到破坏，细胞质嗜酸性增强，细胞核固缩浓染，界限不清；芫根治疗组小鼠海马神经元排列较为紧密，层次清晰，神经元结构较完整，细胞核固缩浓染有不同程度减轻，见图2。

图1 旷场实验测定芫根对脓毒症小鼠认知功能的影响

图2 芫根对脓毒症小鼠海马区神经元形态的影响（HE 染色）

2.3 芫根对脓毒症小鼠脑RACK1/HIF-1α 的调节作用

与对照组小鼠相比，LPS 诱导脓毒症小鼠脑RACK1 蛋白水平明显降低（P＜0.05），HIF-1α 蛋白水平增高；经芫根灌胃后小鼠脑RACK1 蛋白水平相对模型组有所升高，而HIF-1α 的蛋白水平相对降低，见图3。

图3 芫根对脓毒症小鼠脑RACK1/HIF-1α 的影响

3 讨论

脓毒症患者常出现神经系统严重并发症，因此认知功能障碍患病率高，常出现注意力、记忆力下降以及焦虑、抑郁等情绪改变，影响患者正常的生活[10]。本研究采用旷场实验评价不同组别小鼠在旷场箱中不同位置的活动时间，发现脓毒症小鼠总运动时间明显减少，但中央及四周区域的活动相对增多，提示脓毒症小鼠出现明显的焦虑情绪，而给予芫根预处理后可在一定程度上改善小鼠的焦虑情绪，说明芫根可能具有改善脓毒症脑病认知功能的作用。

海马组织在大脑的学习和记忆等方面发挥着重要作用。基于啮齿类动物模型的数据表明，腹侧海马体与情绪、压力、情感有关，而背侧海马体则与学习、记忆、空间导航等相关[11]。因此腹侧海马病变的动物可出现明显的焦虑行为，如明暗探索测试中，从黑盒到白盒的速度更快，在噬食症测试中，开始进食的速度更快等[12,13]。目前研究发现脓毒症患者海马区明显萎缩[14]。本研究结果显示，经LPS 腹腔注射诱导脓毒症后，小鼠海马组织神经元细胞结构破坏，大量神经元细胞变性、坏死，这与之前的报道结果一致[15]；而经芫根预处理后小鼠神经元结构破坏明显减少，说明芫根对海马区神经元损伤具有一定的保护作用。

本研究进一步通过WB 测定脓毒症小鼠脑RACK1 和HIF-1α 的蛋白水平，发现经腹腔注射诱导脓毒症后，模型组小鼠的RACK1 表达降低，与我们之前证实RACK1 在学习记忆的形成和维持以及情绪改变中至关重要再次吻合[16]；同时我们发现RACK1 所调控的 HIF-1α 表达升高，也与既往研究认为RACK1 负性调控HIF-1α 一致[9]，然而由于本次实验样本量有限，目前对于HIF-1α的数据统计未见差异、仅有趋势，未来将通过进一步扩大样本量进行证明。

经芫根治疗后脓毒症小鼠脑RACK1/HIF-1α表达有所逆转，但也因样本数量的限制而未见统计学差异，但趋势明显。

综上所述，芫根防治脓毒症小鼠产生焦虑情绪的作用确切，其机制可能与调控RACK1/HIF-1α、保护海马神经元有关。未来将通过扩大样本量，增加糖代谢重编程等相关因子测定进一步深入研究芫根的药用价值。