响应面法优化槐花枸杞复合米酒发酵工艺

王 鹏

（威海海洋职业学院 食品与药品系，山东 威海 264300）

槐花（Sophora japonicaLinn）又名洋槐花，是豆科植物槐树的花及花蕾，主要分布在中国北方地区[1]。槐花既是清香甘甜的美食，又可入药，属于药食同源的一种花卉。槐花富含活性多糖、芦丁、槲皮素等活性成分，以及微量元素、维生素、蛋白质等营养物质[2-3]，具有降血压、预防冠状动脉硬化、保护心脏、抗氧化、抑菌止血及抗癌的功效[4-6]。枸杞（Lycium chinenseMiller）主要分布在宁夏、新疆、青海、甘肃等西北部省份，是一种药食同源的保健食品[7]，富含蛋白质、多糖、多种维生素、生物碱等活性物质，具有抗疲劳、降三高、提高免疫力、抗癌、延年益寿等保健功效[8-9]。米酒又名酒酿，是以糯米为原料经酒曲发酵而成的低酒精度饮品，在我国有着悠久的历史且分布广泛[10]。米酒色泽大都呈乳白色或淡黄色，香气独特，清甜爽口，含有8种必需氨基酸、维生素、多种矿物质元素、有机酸、低聚糖等营养成分[11-12]，可以提高人体免疫力、调理脾胃、抗衰老、预防老年痴呆症等保健功能[13-15]。

目前在米酒中添加一种花卉增强米酒香气的研究比较常见[16-18]，国内外枸杞酒的研究多为浸泡酒和发酵果酒[19]，枸杞米酒的研究相对较少，秦方园等[20]以枸杞、红枣和大米为原料，采用酒精度、感官评分、总酸和总糖度作为考察指标，制得一款营养价值和感官评分均高的米酒；赵翾等[21]以大米和枸杞为原料，采用感官评价作为响应值，制得一款低酒精度的保健米酒，更鲜有将花卉与枸杞复合添加到米酒中的报道。本研究以鲜槐花、干红枸杞及糯米为原料，研制一款清香爽口、兼具药用价值的复合米酒。在单因素试验基础上考察各因素对槐花枸杞复合米酒品质的影响，采用响应面法优化复合米酒发酵工艺。槐花枸杞复合米酒不仅丰富了米酒的种类，增强了米酒的保健功效，还为槐花、枸杞的深加工和新型米酒开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

食用槐花（鲜花）、红枸杞（干）、糯米：市售；安琪甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；浓硫酸（95.5%）、苯酚（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

PR224ZH/E电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；LRH-150F生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；HR2826打浆机：荷兰飞利浦公司；WBG-1板框过滤器：温州星火食品机械有限公司；SY-50HC36Q电压力锅：浙江苏泊尔股份有限公司；GC-2014气相色谱（gas chromatography，GC）仪：日本岛津公司；TU-1900紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 槐花枸杞复合米酒的制备流程及操作要点

操作要点：

糯米的处理及浸泡：糯米称量去杂、淘洗，米水质量体积比1∶2（g∶mL），室温条件下浸泡（10～12 h），浸泡至糯米手捻即碎的程度[22]。

槐花及枸杞的处理：选择当季鲜槐花、枸杞干果，清洗干净，混合打浆备用。

蒸米：将浸泡好的糯米用压力锅蒸制15～20 min，使米中淀粉充分糊化，达到米粒通透不软烂、米熟无白心、均匀不粘团的程度[23]。

冷却：将蒸好的糯米放置室温通风处，用少量低温纯净水淋洗，并不断翻动降温至30 ℃左右。

混合、拌曲接种：将糯米和槐花、枸杞浆按比例混合均匀，接种一定量酒曲（以干糯米质量计）并搅拌均匀。

搭窝、发酵：将发酵罐中的糯米混合物搭成中间低四周高，呈“倒喇叭”形的凹窝，置于26～34 ℃恒温条件下发酵24～72 h。

过滤、灭菌：将酒液先用无菌纱布初过滤，滤液再经板框过滤器得到澄清酒液，灌入磨砂玻璃酒瓶，采用巴氏杀菌法对酒液进行杀菌[24]，冷却后获得槐花枸杞复合米酒成品。

1.3.2 槐花枸杞复合米酒发酵工艺优化

（1）单因素试验

分别考察酒曲添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、槐花添加量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）、枸杞添加量（6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%）、发酵温度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）对槐花枸杞复合米酒酒精度及感官评分的影响。

（2）响应面试验

在单因素试验结果的基础上，采用4因素3水平的响应面试验，以酒曲添加量（A）、槐花添加量（B）、枸杞添加量（C）、发酵温度（D）为影响因素，以感官评分（Y）为响应值，并进行发酵工艺参数优化，Box-Behnken试验设计因素与水平见表1。

表1 槐花枸杞复合米酒发酵条件优化Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation conditions optimization of sophora flower and wolfberry compound rice wine

1.3.3 分析检测

酒精度检测：参考GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》[25]；菌落总数测定：参考GB 4789.2—2010《食品微生物学检验菌落总数测定》[26]；枸杞多糖检测：采用苯酚-硫酸法[27]；芳樟醇测定：采用气相色谱法，其色谱条件如下：Rtx-1石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），柱温80 ℃，流速0.8 mL/min，进样量1.0 μL[28]。

感官评分：请15位品酒师参考农业行业标准NY/T 1885—2017《绿色食品 米酒》[29]，对米酒色泽、清澈度、香气和风格、口感方面进行综合评分，满分100分，感官评分标准见表2。

表2 槐花枸杞复合米酒感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of sophora flower and wolfberry compound rice wine

2 结果与分析

2.1 槐花枸杞复合米酒发酵工艺优化单因素试验

2.1.1 酒曲添加量对槐花枸杞复合米酒发酵的影响

由图1可知，当酒曲添加量为0.4%～0.8%时，复合米酒酒精度和感官评分随酒曲添加量增加而升高，但由于酒曲添加量不足，发酵产生乙醇能力弱，导致米酒口感寡淡；当酒曲添加量为0.8%时，复合米酒的酒精度、感官评分最高，分别为5.2%vol、93分；当酒曲添加量＞0.8%之后，复合米酒酒精度和感官评分随酒曲添加量增加而降低，因为酒曲含量较高会增加营养物质的消耗[30-31]，从而减弱了无氧呼吸产生乙醇的过程，致使酒精度下降，酒体口感不协调，甚至出现苦涩味。因此，确定复合米酒最适酒曲添加量为0.8%。

图1 酒曲添加量对槐花枸杞复合米酒发酵的影响Fig.1 Effect of Jiuqu addition on the fermentation of sophora flower and wolfberry compound rice wine

2.1.2 槐花添加量对槐花枸杞复合米酒发酵的影响

由图2可知，随着槐花添加量的增加，复合米酒的酒精度基本保持不变，固定酒曲添加量、发酵温度、初始糖度等影响乙醇生成的主要因素，槐花添加量对乙醇的生成没有影响。当槐花添加量为1.0%～3.0%时，感官评分随槐花添加量增加而升高，但复合米酒中花香较弱；当槐花添加量为3.0%时，复合米酒的感官评分达到最大值，为92.5分，酒精度为5.1%vol；当槐花添加量＞3.0%之后，感官评分有所下降，随着槐花添加量的增大，槐花的香气过重，逐渐掩盖酒体自身的香气，使得最终复合米酒中各组分不够协调，涩感明显。因此，确定复合米酒最适槐花添加量为3.0%。

图2 槐花添加量对槐花枸杞复合米酒发酵的影响Fig.2 Effect of sophora flower addition on the fermentation of sophora flower and wolfberry compound rice wine

2.1.3 枸杞添加量对槐花枸杞复合米酒发酵的影响

由图3可知，随着枸杞添加量的增加，复合米酒的酒精度基本保持不变。当枸杞添加量为6.0%～10.0%时，感官评分随枸杞添加量增加而升高，但复合米酒中枸杞的香气和滋味等方面不明显；当枸杞添加量为10.0%时，复合米酒的感官评分达到最大，为93分，酒精度5.2%vol；当枸杞添加量＞10.0%之后，随着枸杞添加量的增大，感官评分有所下降，枸杞味偏重，导致槐花的香气及复合米酒本身的风味凸显不出，感官品质逐渐下降。因此，确定复合米酒最适枸杞添加量为10.0%。

图3 枸杞添加量对槐花枸杞复合米酒发酵的影响Fig.3 Effect of wolfberry addition on the fermentation of sophora flower and wolfberry compound rice wine

2.1.4 发酵温度对槐花枸杞复合米酒发酵的影响

由图4可知，当发酵温度为26～30 ℃时，复合米酒酒精度和感官评分随发温度的增加而升高，但由于温度没有达到酵母菌生长最佳温度，导致其活性不足，发酵不完全；当发酵温度为30 ℃时，复合米酒酒精度、感官评分最大值分别为5.2%vol、93.5分，此时米酒呈橙色，清澈透明，酒香醇厚，有典型的香气；当发酵温度高于30 ℃之后，复合米酒酒精度和感官评分随发酵温度升高而降低，因为较高的温度抑制了酵母菌的生长，使其产生乙醇能力下降，同时温度过高还会促使乙醇挥发，从而降低了米酒的品质[32-33]。因此，确定复合米酒最适发酵温度为30 ℃。

图4 发酵温度对槐花枸杞复合米酒发酵的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on the fermentation of sophora flower and wolfberry compound rice wine

2.2 槐花枸杞复合米酒发酵工艺优化响应面试验

基于单因素试验，选取酒曲添加量（A）、槐花添加量（B）、枸杞添加量（C）、发酵温度（D）为4个评价因素，以感官评分（Y）为考察指标，采用响应面试验设计优化米酒发酵工艺。响应面试验设计及结果见表3。方差分析结果见表4。

表3 槐花枸杞复合米酒发酵工艺优化Box-Behnken试验设计及结果Table 3 Design and results of Box-Behnken tests for fermentation technology optimization of sophora flower and wolfberry compound rice wine

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

通过Design Expert 10.0.7软件对表3中数据进行多元二次回归拟合，得到以槐花枸杞复合米酒感官评分（Y）为响应值的多元二次回归方程模型：Y=93.20-1.91A-2.65B-2.15C-3.65AD-4.28CD-6.86A2-7.15B2-5.18C2-13.61D2。

由表4可知，回归模型的P＜0.000 1，模型极显著，失拟项的P=0.162 3＞0.05，失拟项不显著，说明本试验模型和实验结果拟合度好，该模型能够很好地的确定槐花枸杞复合米酒的最佳发酵工艺。由P值可知，一次项B，二次项A2、B2、C2、D2均对复合米酒感官评分有极显著影响（P＜0.01）；一次项A、C，交互项AD、CD均对复合米酒感官评分有显著影响（P＜0.05）；一次项D，交互项AB、AC、BC、BD对结果无显著性影响（P＞0.05）。由F值可知，各因素对感官评分影响顺序由大到小为：槐花添加量（B）＞枸杞添加量（C）＞酒曲添加量（A）＞发酵温度（D）。

2.3 各因素间交互作用分析

各因素间交互作用对槐花枸杞复合米酒感官评分影响的响应面及等高线见图5。

由图5可知，响应曲面坡度越陡，等高线越接近椭圆，表明二者交互作用越显著[34-35]。酒曲添加量和发酵温度之间的交互作用对感官评分（Y）有显著的影响，当酒曲添加量和发酵温度均在0水平即（0.8%）和（30 ℃）范围内，两因子对感官评分的影响呈显著正交互作用；枸杞添加量和发酵温度之间的交互作用对感官评分（Y）有显著的影响，当酒曲添加量和发酵温度均在0水平即（10.0%）和（30 ℃）范围内，两因子对感官评分的影响呈显著正交互作用，与表4方差分析结果一致。

图5 各因素间交互作用对槐花枸杞复合米酒感官评分影响的响应曲面与等高线Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on sensory scores of sophora flower and wolfberry compound rice wine

通过Design-Expert 10.0.7软件对模型进行优化，得到复合米酒的最佳发酵工艺条件：酒曲添加量0.690%、槐花添加量2.847%、枸杞添加量9.834%、发酵温度30.045 ℃，在此条件下，制得复合米酒感官评分理论值为93.684分。为满足实际可行性操作，将最佳工艺参数调整为：酒曲添加量0.7%、槐花添加量2.8%、枸杞添加量9.8%、发酵温度30 ℃，在最佳工艺参数下进行3次验证试验，得到复合米酒感官评分实际平均值为93.5分，与理论值的误差为0.196%，因此该工艺准确可靠，是可行的。

2.4 产品质量指标结果

在最佳工艺条件下制得的槐花枸杞复合米酒清澈透明、酒香浓郁、酒体醇厚、清爽绵柔、槐花和枸杞风格突出；感官评分93.5分，酒精度5.2%vol，芳樟醇含量为3.67 mg/L，枸杞多糖含量为26.83 mg/100 mL，菌落总数为27 CFU/mL，大肠菌群＜3 MPN/100 mL，达到商业无菌，符合米酒的国标NY/T 1885—2017《绿色食品米酒》卫生要求。

3 结论

该研究通过单因素试验和响应面试验确定了各因素对米酒发酵的影响趋势，并以感官评分为考察指标优化槐花枸杞复合米酒发酵工艺。结果表明，最佳发酵条件为酒曲添加量0.7%、槐花添加量2.8%、枸杞添加量9.8%、发酵温度30 ℃。此优化条件下，制得槐花枸杞复合米酒的感官评分为93.5分，酒精度为5.2%vol，是一款清香爽口，兼具药用价值的保健米酒，为我国新型米酒研发提供了新的方向。