HPLC法同时测定追风八珍酒中7种有效成分

李先芝，胡 杨，杨 峰，毛琼丽，刘 洋，朱 艳，石 豪，严 玲

（1.劲牌有限公司，湖北 黄石 435100；2.中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北 黄石 435100）

我国是具有浓厚酒文化的国度，酒类产品已成为人们日常生活交往中不可或缺的饮品。随着我国经济的快速发展以及人们生活水平的提高，人们的消费观念正悄然发生着变化，对白酒的品质要求越来越高，同时逐步趋向于健康饮酒。保健酒作为一种具有某些功能特性的露酒，逐步受到广大消费者的青睐，因此保健酒市场已逐步成为保健食品市场的重要分支[1]。

追风八珍酒是以清香型白酒为基酒，佐以黄芪、杜仲、五加皮、枸杞、木瓜、黑桑葚、天麻、黄精、肉桂9味药材，运用中医理论精制而成的一款具有增强免疫力功效的保健酒。黄芪作为一种常见的滋补类中药备受国人的推崇。研究表明，黄芪中含有丰富的皂苷类[2]、毛蕊异黄酮以及多糖类[3-4]，而毛蕊异黄酮作为黄芪中的主要活性成分之一在抗炎[5]、抗氧化[6]、抗癌[7]等方面具有显著功效。松脂醇二葡萄糖苷是杜仲中含量最丰富的木脂素类化合物之一，是杜仲的特征性成分[8]，在降血压和缓解骨质疏松方面具有显著效果[9-10]。绿原酸、原儿茶酸是一种广泛分布于植物中的多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎、增强免疫力、降血压降血糖、抑菌等功效[11-16]，已有研究人员在五加皮、枸杞、木瓜、黑桑椹中鉴别出了绿原酸及原儿茶酸[17-20]。巴利森苷A、巴利森苷B是从天麻中分离鉴定出的质量标志物[21-22]，现代医学表明，巴利森苷类成分在神经保护、镇痛等方面具有显著效果[23-24]。黄精、肉桂是我国传统的药食两用药材。其中黄精多糖是黄精的主要成分之一[25]，具有抗氧化、免疫调节等多种作用[26-27]。而肉桂常作为香料使用，在消炎抗菌、抗氧化方面有显著成效[28-30]。

随着人们保健意识的增强，对保健酒的需求越来越大，基于此，越来越多的研究者对保健酒进行了深入的研究[31-33]，但截至目前，同时检测追风八珍酒中7种有效成分的文献尚未报道。本研究将原儿茶酸、绿原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷、巴利森苷A、芦丁作为追风八珍酒的标志性成分，采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）对追风八珍酒中的标志性成分进行检测，为后期生产过程中的质量监控及评价提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

5批追风八珍酒：由劲牌有限公司提供。

原儿茶酸（批号110809-201205，含量99.9%）、绿原酸（批号110753-202018，含量96.1%）、松脂醇二葡萄糖苷（批号111537-201706，含量91.7%）、芦丁（批号100080-201610，含量91.9%）：中国食品药品检定研究院；巴利森苷B（批号B20912，含量98%）、巴利森苷A（批号B20932，含量98%）、毛蕊异黄酮苷（批号B20837，含量100%）标准品：上海源叶生物科技有限公司。

乙腈、磷酸（均为色谱级）：美国Fisher公司；甲醇、乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

UltiMate 3000高效液相色谱仪：美国赛默飞公司；SQP电子分析天平：德国赛多利斯公司；SK1200H 数控超声波清洗仪：上海科导超声仪器有限公司；RE-2002旋转蒸发仪：郑州科达机械仪器设备有限公司；HLB（SelectCore HLB 200 mg 6 mL）固相萃取柱：纳谱分析技术（苏州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 混合标准品溶液的配制

精密称取原儿茶酸、绿原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷、巴利森苷A、芦丁标准品适量，加体积分数50%的甲醇溶解，制成不同质量浓度的标准品溶液。

1.3.2 供试品（样品）预处理

取酒样10 mL至茄形瓶中，于50 ℃减压蒸干，用5 mL水溶解残渣，上HLB固相萃取柱，用10 mL水预洗，去掉洗脱液，再用10 mL体积分数50%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，于50 ℃减压蒸干，残渣用体积分数50%的甲醇溶液溶解，定容至5 mL。

1.3.3 追风八珍酒中7种有效成分的分析检测

采用HPLC法分析7种有效成分含量，其色谱条件：色谱柱为Agilent Sb-Aq色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱程序见表1；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长210 nm；进样量20 μL。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

1.3.4 有效成分含量的测定

根据原儿茶酸、绿原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷、巴利森苷A、芦丁标准品在色谱图上的保留时间对追风八珍酒样品中的原儿茶酸、绿原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷、巴利森苷A、芦丁成分进行定性分析，同时以标准品浓度与样品峰面积的比值，依据标准曲线得到各物质的含量。计算公式如下：

式中：cx为样品中各有效成分的含量，mg/L；cr为标准品质量浓度，mg/L；Ax为样品峰面积；Ar为标准品峰面积；2为样品处理过程浓缩至50%的换算系数。

1.3.5 数据分析

利用仪器自带的软件Chromeleon7用于查看色谱图、绘制标准曲线，利用Excel 2019软件处理数据。

2 结果与分析

2.1 7种有效成分测定

在“1.3.3”项色谱条件下将7种有效成分混合标准品及酒样进行进样测定，HPLC色谱图见图1。由图1可知，7种有效成分混合标准品及酒样在相同时间下均有色谱峰出现，表明追风八珍酒中含有原儿茶酸、绿原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷、巴利森苷A、芦丁这7种有效成分。

图1 追风八珍酒7种有效成分标准品（A）及样品（B）HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of 7 active ingredients standard (A) and sample (B) of Zhuifeng Bazhen liquor

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系试验考察

将“1.3.1”项下标准品溶液稀释成5个不同质量浓度水平的标准品混合溶液，按照“1.3.3”项色谱条件下进样测定，以物质质量浓度为横坐标（X），相对应的色谱峰面积为纵坐标（Y）建立标准曲线，得出线性关系及范围，结果见表2。由表2可知，各成分在各自质量浓度范围内线性关系良好，相关系数r均＞0.999，线性回归方程、线性范围、检测限和定量限结果见表2。

表2 追风八珍酒7种有效成分的标准曲线回归方程、线性范围、检测限及定量限Table 2 Standard curve regression equation,linear range,limit of detection and limit of quantification of 7 active ingredients of Zhufeng Bazhen liquor

2.2.2 精密度试验

取同一酒样，按照1.3.2的方法制备供试品，按1.3.3项下含量检测色谱条件连续进样6次，记录峰面积并计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表3。由表3可知，7种有效成分原儿茶酸、绿原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷、巴利森苷A、芦丁峰面积的RSD分别为0.27%、0.35%、0.92%、0.96%、1.26%、0.90%、1.54%，均＜2%，表明该仪器精密度良好。

表3 7种有效成分分析的精密度试验结果Table 3 Precision test results of 7 active ingredients analysis

2.2.3 稳定性试验

取同一供试品溶液，检测按1.3.3的条件分别于0 h、6 h、14h、19h、24h、29h进样，记录峰面积，检测结果见表4。由表4可知，7种有效成分原儿茶酸、绿原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷、巴利森苷A、芦丁峰面积的RSD分别为0.51%、0.42%、1.97%、0.87%、1.28%、0.73%、0.89%，表明供试品溶液中各成分在室温条件下放置29 h内稳定性良好。

表4 7种有效成分分析的稳定性试验结果Table 4 Stability test results of 7 active ingredients analysis

2.2.4 重复性试验

取同一酒样，按照1.3.2的方法制备供试品6份，分别按1.3.3的条件进行进样，记录含量，检测结果见表5。由表5可知，7种有效成分原儿茶酸、绿原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷、巴利森苷A、芦丁含量的RSD值分别为0.35%、0.32%、1.74%、1.31%、0.65%、0.66%、1.90%，均＜2%，表明该方法重复性良好。

表5 7种有效成分分析的重复性试验结果Table 5 Repeatability test results of 7 active ingredients analysis

2.2.5 加标回收率试验

精密量取已知含量的同一酒样5 mL至茄形瓶中，分别按照酒样中各成分含量的低、中、高三个水平加入适量标准品，按照1.3.2的方法制备供试品9份，按1.3.3的条件进行测定，计算各成分加标回收率，结果见表6。由表6可知，7种有效成分原儿茶酸、绿原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷、巴利森苷A、芦丁平均加标回收率分别为94.50%、96.33%、95.68%、97.44%、97.56%、97.37%、98.82%。加标回收率的RSD分别为1.99%、1.76%、2.39%、1.90%、1.75%、2.67%、2.85%，均＜5%，表明该方法准确度高。

表6 7种有效成分分析的加标回收率试验结果Table 6 Standard recovery rate test results of 7 active ingredients analysis

2.3 样品含量测定

取5批次追风八珍酒样品，按照1.3.2的方法制备供试品，分别按1.3.3的条件进行进样，计算各批次追风八珍酒样品中各成分的含量，结果见表7。由表7可知，5批次的追风八珍酒中原儿茶酸、绿原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷、巴利森苷A、芦丁含量的RSD均＜2%，表明追风八珍酒的生产工艺较稳定。

表7 各批次追风八珍酒样品中7种有效成分含量Table 7 Content of 7 active ingredients in each batch of samples of Zhuifeng Bazhen liquor

3 结论

本研究建立了HPLC法测定追风八珍酒中原儿茶酸、绿原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷、巴利森苷A、芦丁的含量，该方法操作简便，重复性好，准确度高，可为后期追风八珍酒生产过程中的质量监控及评价提供参考依据。