基于GC×GC-TOF-MS法比较两种不同香型白酒的挥发性香气成分

程 伟，陈雪峰，陈兴杰，潘天全，薛锡佳，周 端，付 欢

（1.陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安 710021；2.安徽金种子酒业股份有限公司，安徽 阜阳 236023；3.陕西农产品加工技术研究院，陕西 西安 710021）

中国白酒经过2 000多年的酿造历史和发展，已逐渐形成12种香型[1-3]；其中，大曲清香型白酒通常以低温大曲作为糖化发酵剂[4]，采用“两遍清”酿造工艺，以地缸作为发酵容器，突出乙酸乙酯和乙酸乙酯为主体的花果样香气；复合香型白酒是由2种或2种以上基本香型复合所派生出来的白酒香型，具有工艺复杂、香气复合、风味层次多样等特点。金种子馥合香白酒（属于复合香型白酒）采用“多曲并用、高温堆积、分层出醅、分类蒸酒”的酿造工艺，“泥底砖壁”窖池作为发酵容器，其主体香气成分较为复杂，具有“香气复合幽雅”的风格特点[5]。顶空固相微萃取法（head space-solid phase microextraction，HS-SPME）作为白酒样品前处理的有效方法，具有操作简单快速等特点，已广泛应用于白酒香气成分研究领域[6-7]。1985年，PHILLIPS J B等[8-9]发明了全二维气相色谱-飞行时间质谱（two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOF-MS）技术，解决了一维气相色谱（one-dimen-sional gas chromatography，1DGC）不能有效分离复杂样品中众多成分的问题，其分辨率和灵敏度均较高，峰容量也较大；因而，该技术在复杂样品挥发性成分分离方面具有重要的应用前景。

当前，GC×GC-TOF-MS技术已应用到酒类香气成分的分离鉴定并取得了相应的应用效果[10-12]。然而，关于江淮地区复合香型白酒中挥发性香气成分的GC×GC-TOF-MS分析报道较少，尤其是关于大曲清香型白酒和复合香型白酒中挥发性香气成分的对比研究还鲜有报道。本实验采用顶空固相微萃取结合全二维气相色谱-飞行时间质谱法（HS-SPME-GC×GC-TOF-MS）分别对大曲清香型白酒和复合香型白酒中的挥发性香气成分进行检测并对比分析，有助于增进对这2种香型白酒香气特点及其特征成分的认识，为明确复合香型白酒的香气特点提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

复合香型白酒（金种子馥合香特级原酒，酒样编号为FH，酒精度为63.5%vol）、大曲清香型白酒（特级原酒，酒样编号为DQ，酒精度为65.2%vol）：安徽金种子酒业股份有限公司；氯化钠、无水硫酸钠（均为分析纯）：中国医药集团化学试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Pegasus 4D全二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GCTOF-MS）仪：美国LECO公司；7890A气相色谱仪：美国Agilent公司；57330-U手动SPME进样器、2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头：美国Supelco公司；Mili-QAdvantage超纯水系统：美国Millipore公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验酒样的前处理

采用去离子水分别将酒样FH和DQ的酒精度稀释到10%vol，置于4 ℃密封避光保存。

1.3.2 顶空固相微萃取方法

参照GAO W J等[13]的方法，在萃取时间上略有调整；取5 mL实验酒样加入20 mL的顶空瓶中，并加盖密封，在50 ℃条件下恒温15 min；随后将萃取头插入顶空瓶中再萃取30 min后，将萃取头立即插入250 ℃的GC进样口解吸附5 min，按照设定参数进行GC×GC-TOF-MS分析，相同条件下进样3次；萃取头在每次使用前插入240 ℃的GC进样口解吸10 min。

1.3.3 GC×GC-TOF-MS仪器分析方法[14]

气相色谱条件：第一维柱为DB-WAX色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm），进样温度250 ℃，初始温度40 ℃保留5 min，以5 ℃/min升至220 ℃，以20 ℃/min升至250 ℃，保留2.5 min；载气为氦气（He）（纯度99.999 9%），流速1.0 mL/min，无分流，进样量0.5 μL。第二维柱为DB-17MS色谱柱（2 m×100 μm×0.10 μm），柱温高于第一维柱5 ℃，调制解调器温度始终保持高于第二维柱5 ℃，两根色谱柱以串联方式连接，全二维分析调制周期4.0 s。

质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，传输线温度280 ℃；检测器电压1 365 V，采集质谱扫描范围35～500 amu、采集频率100spectrum/s。

1.3.4 GC×GC-TOF-MS数据处理

采集的TOF-MS数据由美国LECO公司Chroma TOF工作站进行处理，自动识别信噪比＞50的色谱峰并比对美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）14和Wiley 9质谱库，经过人工解谱与同系物二维色谱出峰规律比对后，去除烷烃类等没有风味贡献的化合物；再选择相似度与反相似度均＞700，可能性＞4 000的化合物，在Chroma TOF软件中建立保留指数计算方法；再确定化合物一维色谱柱保留指数，并与文献报道的保留指数比对，选择数值差异在50以内的化合物作为鉴定结果[15]。

1.3.5 数据分析

采用WPS Office Excel 2019进行数据处理，并对鉴定结果中主要香气成分的种类和香气感官特点进行分类，采用Cytoscape 3.7.1软件绘制关联网络图。

2 结果与分析

2.1 白酒挥发性香气成分GC×GC-TOF-MS分析总离子流色谱图

基于全二维气相色谱的分离机理以及DB-WAX（30 m×250 μm×0.25 μm）色谱柱和DB-17MS（2 m×100 μm×0.10 μm）色谱柱的特性，本实验采用一维DB-WAX色谱柱搭配二维DB-17MS色谱柱，分别对2种不同香型白酒中的挥发性香气成分进行分离，2D总离子流色谱图见图1。

图1 酒样DQ（a）和FH（b）中挥发性香气成分GC×GC-TOF-MS分析总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatograms of volatile aroma components in Baijiu samples DQ (a) and FH (b) analyzed by GC×GC-TOF-MS

由图1可知，白酒中的挥发性香气成分通过二维色谱获得了一定的分离效果，但是仍然存在共流出现象，还有待于进一步分析原因。采用该技术在样品DQ和FH中检测到的色谱峰分别为316个和729个，采用多级鉴定策略确认了可信度较高的挥发性香气成分分别为251种和341种，表明样品FH中的挥发性香气成分较DQ复杂。

2.2 GC×GC-TOF-MS法测定不同香型白酒的挥发性香气成分

GC×GC-TOF-MS法测定2种不同香型白酒挥发性香气成分类别及数量，结果见表1。由表1可知，酒样DQ和FH中分别鉴定出可信度较高的挥发性香气成分251种和341种；其中，酯类分别为56种和117种，醇类分别为54种和70种，有机酸类分别为38种和43种，醛、酮、缩醛类分别为30种和47种，挥发性含硫化合物分别为6种和14种，含氮化合物分别为6种和9种（酒样FH中鉴定出吡嗪类7种），呋喃类分别为21种和16种，其他类化合物分别为40种和25种。

表1 酒样DQ和FH中挥发性香气成分类别及数量Table 1 Types and quantities of volatile aroma components in Baijiu samples DQ and FH

综上表明，酒样DQ和FH中的主要挥发性香气成分包括酯类、醇类、酸类、醛酮类等化合物；其中，大部分的酯类具有瓜果样香气，醇类和酸类赋予酒体饱满或醇厚的感官及滋味，醛酮类通常具有特殊香气，各类挥发性香气成分的复合及协同形成了酒样DQ和FH不同香型白酒的独特感官及风格特征。由于含氮、含硫及呋喃类化合物通常具有特殊香气或生理功能，且阈值较低，虽然在酒体中的种类或含量较少，但可能对酒体的香气具有重要影响；因而，在鉴定出的挥发性香气成分中着重对比分析了含氮、含硫和呋喃类化合物。

2.2.1 呋喃类化合物

呋喃类化合物是构成许多天然食品香气特征的重要成分，具有阈值低、香气独特等特点，包括呋喃酯类、呋喃醇类、酰基呋喃类、其他呋喃类化合物等。有研究表明，呋喃类化合物是酱香型白酒的重要呈香物质和特征化合物[16]。GC×GC-TOF-MS法测定不同香型白酒中呋喃类化合物，结果见表2。由表2可知，酒样DQ和FH中均鉴定出的呋喃类化合物有5种，分别是苯并呋喃、呋喃、2-甲基-呋喃、2-戊基-呋喃、糠醛；其中，苯并呋喃由稠合的杂环化合物组成，具有广泛的生物作用，如抗菌、抗肿瘤和抗炎等[17]。酒样FH中鉴定出特有的乙酸糠酯、2-乙基-5-甲基呋喃、5-甲基-呋喃醛、2-正戊基-呋喃等均具有特殊香气，而酒样DQ中未检测到这几种呋喃类化合物。呋喃类化合物是白酒中重要的呈香和功能性物质，酿酒工艺及蒸馏环境是影响酒体中呋喃类化合物种类及含量的重要因素。

表2 酒样DQ和FH中呋喃类化合物GC×GC-TOF-MS分析结果Table 2 Results of furan compounds in Baijiu samples DQ and FH analyzed by GC×GC-TOF-MS

续表

2.2.2 含硫化合物

挥发性含硫化合物在食品及酒精饮料中的含量极低，其具有香气阈值极低、香气独特等特点，食品中含硫化合物的检测具有较强的挑战性[18]。GC×GC-TOF-MS法测定不同香型白酒中含硫化合物，结果见表3。由表3可知，酒样DQ和FH中鉴定出的含硫化合物分别为6种和14种，在酒样DQ中鉴定出的6种含硫化合物均在酒样FH中被检测到；另外，在FH中还检测到特有的8种含硫化合物，均具有特殊香气。酒样FH中鉴定出的三甲基二硫具有冷薄荷气味和辛香香气，2-噻吩甲醛具有类似杏仁香气，硫代丁酸甲酯具有乳酪、番茄、硫化物样香气[19]，该类香气成分可能对酒样FH复合香气的形成具有重要作用。综上可知，酒样FH中鉴定出的8种特有含硫化合物均可作为区别于酒样DQ的特殊香气成分。

表3 酒样DQ和FH中含硫化合物的GC×GC-TOF-MS分析结果Table 3 Results of sulfur compounds in Baijiu samples DQ and FH analyzed by GC×GC-TOF-MS

续表

酒样FH的酿造采用“多曲并用”工艺，粮醅经过“高温堆积”过程，有利于耐高温产蛋白酶细菌菌群的代谢，促进了原料中含硫蛋白质的分解与转化，可能产生对酒体香气具有积极贡献的含硫化合物。酒样DQ酿造过程中采用低温大曲、“两遍清”工艺，其制曲温度与粮醅发酵温度均低于馥合香白酒，酿造体系中的霉菌及适宜中低温的细菌菌群较为丰富；因而，其酒体中酯类和含硫化合物的含量和种类与馥合香白酒相比明显较低，其酒体较为“醇净”。

2.2.3 含氮化合物

白酒中的含氮化合物以吡嗪类为主，该类化合物通常具有特殊香气，如2-甲基吡嗪具有烤面包、烤杏仁或炒花生似的香气，2,5-二甲基吡嗪具有炒豆似的香气，三甲基吡嗪具有咖啡香、烤面包香气[20]。吡嗪类化合物对促进白酒的香气优雅具有积极作用，该类物质是酱香和芝麻香等香型白酒中的重要香气成分和特征物质[21-22]；其中，四甲基吡嗪具有扩张血管、改善微循环及抑制血小板积聚、增强机体免疫等多种生物活性[23]。GC×GC-TOF-MS法测定不同香型白酒中的含氮化合物，结果见表4。由表4可知，酒样DQ和FH中鉴定出的含氮化合物分别为6种和9种，包括在酒样FH中检测到特有的7种吡嗪类化合物；因此，该7种特有的吡嗪类化合物可作为酒样FH区别于酒样DQ的特殊香气成分。

表4 酒样DQ和FH中含氮化合物的GC×GC-TOF-MS分析结果Table 4 Results of nitrogen-containing compounds in Baijiu samples DQ and FH analyzed by GC×GC-TOF-MS

白酒中的吡嗪类物质主要来源于美拉德反应、微生物代谢、蛋白质和氨基酸的热分解等过程，具有特殊生物活性的吡嗪类物质（如四甲基吡嗪）赋予中国白酒以健康功能[24]。酒样FH的酿造采用高温大曲、芝麻香麸曲和中温大曲的分阶段使用，其制曲、粮醅堆积与固态发酵温度均明显高于大曲清香型白酒，促进了美拉德反应的进行，有利于产生和积累吡嗪类物质；而且配糟发酵工艺也有利于吡嗪类物质在酒体中的积累。对酒样DQ的酿造而言，其制曲和发酵温度均不高[25-26]，以及采用的“两遍清”工艺均不利于吡嗪类物质的产生与积累。

2.3 DQ与FH的主要香气成分及其感官特征的关联网络

对酒样DQ与FH鉴定结果中主要香气成分及其感官特征进行关联分析，以建立关联网络见图2。外围区域相同颜色的各点代表香气成分类别，内部区域不同颜色的各点代表香气感官属性。由图2可知，酒样DQ中的水果气、青草气、甜气等6种香气感官属性均可被GC×GC-TOF-MS香气成分的鉴定结果解释；酒样FH香气感官属性中的香酯气、水果气、甜气等9种香气感官属性均可被GC×GC-TOF-MS香气成分的鉴定结果解释。关联网络结果也表明，酒样FH的香气明显比DQ丰富，FH的水果气关联成分明显，这与FH中酯类物质的种类明显较DQ多有关。香气成分及其感官特征关联分析结果表明，酒样FH与DQ相比，具有“香气复合幽雅”的风格特点。

图2 酒样DQ（a）和FH（b）中主要挥发性香气成分及其感官特征关联网络图Fig.2 Associated network diagram of main volatile aroma components and sensory characteristics in Baijiu samples DQ (a) and FH (b)

本研究建立的酒体中主要挥发性香气成分及其感官特征的关联网络，但是并没有进行香气成分的定量和酒样的感官品评等，这虽然不能充分明确酒体中的关键或特征香气成分，但在一定程度上反映了GC×GC-TOF-MS香气成分鉴定结果的可信度。Pearson相关系数法可以评估2个连续变量之间的线性关系，因此采用Pearson分析建立酒样DQ和FH的感官品评结果与香气成分定量结果之间的关联网络，对认识酒样DQ和FH的香气特征具有重要意义，还有待于深入研究。

3 结论

由于原料、工艺、发酵容器及环境等因素的影响，导致不同香型白酒中香气物质及特征成分的差异，酒体的感官风格也存在较大差异。本实验基于HS-SPME-GC×GC-TOFMS法分别检测酒样DQ和FH中的挥发性香气成分，并进行对比分析。结果表明：采用多级鉴定策略，分别在酒样DQ和FH中确认了可信度较高的挥发性香气组为251种和341种，主要包括酯类、醇类、酸类、醛酮醛类，还包括呋喃类、含氮、含硫以及其他化合物；在FH中鉴定出特有的挥发性含硫化合物和吡嗪类化合物分别为8种和7种，其均具有特殊香气或生物活性，均可作为区别于DQ的特殊香气成分；采用香气成分及其感官特征的关联网络分析方法，在一定程度上反映了GC×GC-TOF-MS香气成分鉴定结果的可信度。本实验有助于增进对大曲清香、复合香等香型白酒香气特点及其特征成分的认识，为明确酒样DQ和FH中的香气特点提供基础。