miR-134在脑卒中后认知障碍患者血清中表达及意义

赵嘉培，洪志评，刘 辉，张军能，黄赛娥

（1.厦门市第五医院，福建 厦门 361101；2.福建中医药大学附属康复医院，福建 福州 350001）

认知功能障碍是脑卒中常见的后遗症，不但阻碍患者的全面康复，而且严重地影响其日常生活活动、社会参与、重返职场等[1]。脑卒中患者的早期认知诊断对帮助医生识别那些存在高风险并可能继续发展的脑卒中认知功能障碍（poststroke cognitive impairment, PSCI）具有很重要的临床意义的[2]。近年来，血清microRNAs（miRNAs）作为生物学标志物在神经系统认知疾病中的作用逐渐受到关注。在阿尔茨海默病（Alzheimer's disease,AD）的研究过程中，Nimmi 等人首次证明了miR-134 介导的CREB-1 和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）的转录后调控是该病可塑性缺陷的重要分子机制，提示miR-134-5p 作为AD 患者恢复可塑性的潜在治疗靶点作用[3]。BDNF 是与突触可塑性和记忆形成有关的重要的可塑性相关蛋白之一，海马突触可塑性在很大程度上依赖于BDNF 的可用性[4]。近年来的研究发现[5]，丰富的环境可以通过激活海马SIRT1/miR-134 通路并上调下游BDNF 的表达来逆转认知缺陷。因此，本研究的主要目的在于检测miR-134及其下游靶基因BDNF 在PSCI 患者血清样本中是否发生有意义的变化。为验证这个假设，本研究招募了来自PSCI、脑卒中后认知功能正常（post-stroke cognitive normality, PSCN）及年龄匹配对照组（agematched controls,AMC）患者的血液样本，并通过实时荧光定量PCR（Real Time Quantitative PCR,RT-qPCR）技术来检测miR-134 的相对表达水平，酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）技术来检测BDNF 表达水平，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 病例来源 本研究通过了厦门市第五医院伦理委员会的批准（伦理委员会批准文号：2017-XMSDWYY-012），受试者均签署了知情同意书。研究招募来自厦门市第五医院康复医学科的56名脑卒中患者（其中认知功能正常组29 例，认知障碍组27 例）以及28 名非神经系统患者作为对照组被试。所有纳入被试年龄为55-80 岁，且脑卒中患者和对照组被试的年龄、性别、受教育程度相匹配。

1.2 脑卒中后认知功能障碍组（PSCI）纳入与排除标准 纳入标准：①本人或法定监护人同意并已签署知情同意书；②首次脑卒中，符合《中国各类主要脑血管病诊断要点2019》[6]中“脑卒中”的诊断标准，病程≤1 年；③蒙特利尔认知评估量表（Montreal Cognitive Assessment,MoCA）＜26 分；④病情稳定，意识清醒，生命体征稳定。排除标准：①经检查证实有脑肿瘤、脑外伤、脑寄生虫病等可引起认知功能障碍的其他疾病者；②存在严重言语、视力、听力障碍或精神障碍等影响认知检查者；③经既往病历或临床医生或家属证实其之前已经患有认知障碍的相关疾病或在发病前有使用针对认知障碍的药物；④贝克抑郁量表（Beck Depression Inventory,BDI）＞13 分；⑤有酒精、药物滥用史；⑥合并有严重的心、肝、肾、内分泌系统和造血系统等疾病者；⑦妊娠及哺乳期女性；⑧正在参加影响本研究结果评价的其它临床试验者。

1.3 卒中后认知功能正常组（PSCN）纳入与排除标准 纳入标准：①为同期住院缺血性脑卒中患者；②蒙特利尔认知评估量表（MoCA）≥26 分；③其余条目皆与卒中后认知功能障碍组相一致。排除标准：与卒中后认知功能障碍组一致。

1.4 对照组（AMC）纳入标准 纳入标准：①来自本院同期科室内非神经系统疾病患者；②无认知功能减退的主诉；③总体认知功能正常，MoCA筛查评分≥26。排除标准：①排除痴呆、脑血管病及其他存在或可引起认知功能障碍的中枢神经系统疾病；②存在严重言语、视力、听力障碍或精神障碍等影响认知检查者；③其余与卒中后认知功能障碍组后五条一致。

1.5 检测方法 收集脑卒中患者和对照组全血，样本为患者入院后首次采集的血液，于清晨空腹采取外周肘正中静脉血4ml，置于无添加剂普通采血管中，3 小时内在室温下3000rpm 离心5min 去除血细胞并收集上层血清，然后将收集的上层血清在4°C 条件下，13000rpm 离心5inin,进一步去除残留的血细胞，离心后收集血清置于-80°C 冰箱保存待用。排除溶血的样本或血清量少的等不合格样本。

1.5.1 核酸提取与逆转录 采用北京康为世纪生物科技有限公司miRNA 提取试剂盒（型号：CW0627）进行miRNAs 提取，操作步骤严格按说明说执行。miRNAs 浓度及纯度检测采用德国Thermo 公司NanoDrop 2000c 分光光度计。本研究miRNA 浓度范围：50-102 ng/l；miRNA 纯度范围：A260/A280比值：1.81-2.02。逆转录采用南京诺唯赞生物科技有限公司的HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（型号：R222-01），实验过程按说明书步骤进行。

1.5.2 RT-qPCR 实时检测microRNAs采用南京诺唯赞生物科技有限公司的ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（Low ROX Premixed）（型 号：Q431-02）。实验过程按说明书步骤进行。用U6作为内部参考，然后使用2-ΔΔCt方法计算miR-134的相对表达。内参基因和目的基因引物由博创盛世设计，厦门铂锐生物合成，其序列为：

1.5.3 血清BDNF 测定 采用ELISA 技术测定三组患者血清BDNF 浓度，采用北京四正柏生物科技有限公司的Human BDNF 试剂盒（型号：CHE0041），测 定 仪 为Spectramax Absorbance Reader 全自动酶标仪，各项操作具体程序严格按照试剂盒的说明书执行。

1.6 统计分析 采用SPSS 20.0 (IBM)分析数据。Mann-Whitney U 检 验 比 较AMC 组、PSCN 组 及PSCI 组的miR-134 相对表达和BDNF 水平；ANOVA 和χ2检验用于计量和计数资料中；Spearman 相关分析对miR-134 表达水平和MoCA 得分、BDNF水平进行比较。采用ROC曲线（receiver operator characteristic curve, ROC）和曲线下面积（Area under the Curve，AUC）对miR-134 的诊断能力进行评估。最大特异性和最大灵敏度的总和作为最佳诊断临界点（cut-off point）。所有例数，包括真阳性（true positive,TP）、真阴性（true negative,TN）、假阳性（false positive,FP）、假阴性（false negative, FN）都是通过最佳临界点计算而来。灵敏度、特异性、准确性的计算公式如下：灵敏度=TP/（TP+FN）=真阳性例数/所有阳性例数；特异性=TN/（TN+FP）=真阴性例数/所有阴性例数；准确度=（TN+TP）/（TN+TP+FN+FP）=所有正确诊断例数/所有例数。

2 结果

2.1 三组患者一般资料比较 人口统计学数据、生化数据见表1。其中，在AMC 组、PSCN 组、PSCI组组间糖尿病、高血压例数存在显著统计学差异。

表1 三组一般资料情况

2.2 三组患者的血清miRNA 表达水平比较miRNAs 的Ct 值见表2，其中，在AMC 组、PSCN 组、PSCI 组组间MoCA 评分存在显著统计学差异。U6是本研究的内参，其Ct值在3组间无显著统计学差异（P= 0.13）。血清miR-134 的相对表达水平是通过内参Ct 值标准化得来的（2-ΔΔCt）。miR-134 的表达水平在3 组间存在显著统计学差异（Kruskal-Wallis 检验,P＜0.01）。PSCI 组miR-134 及BDNF 表达水平最低，PSCN 组次之，AMC组最高。miR-134 及BDNF 表达水平，在PSCI 组和PSCN 组组间两两比较结果为：存在显著统计学差异（Mann-Whitney 检验,P＜0.01）；在PSCI组和AMC 组组间两两比较结果为：存在显著统计学差异（Mann-Whitney 检验，P＜0.01）。这些结果表明，目前所观察到的样本是适合于进一步分析的。与其他两组相比，PSCI 组患者血清miR-134的相对表达是显著下调（P＜0.01）。

表2 三组血清miR-134及BDNF水平比较

2.3 miR-134 相对表达水平与认知功能间相关性本研究分析了MoCA 得分与血清miR-134间的相关性。通过进行Spearman 相关分析，结果显示MoCA 得分与血清miR-134 相对表达间存在中度正相关（r=0.613,P＜0.01）（图1）。

图1 miR-134相对表达水平与认知功能间相关性

2.4 miR-134 诊断性能用于筛查PSCI 本研究采用ROC 曲线和AUC 对miR-134 的诊断能力进行评估，见图2。采用SPSS 20.0 对miR-134 的相对表达量进行ROC曲线分析，ROC曲线图见图2-6，得 到AUC（95%CI）为0.849（0.749-0.948）（P＜0.01），在0.7-0.9 范围内，表明miR-134 诊断脑卒中后认知功能障碍的价值中等。Cut-off point 根据SPSS 中统计结果中的特异度和灵敏度的总和最大值得出，Cut-off point=0.82。根据Cut-off point 计算得出TP 为24 例、FP 为11 例、TN 为18例、FN 为3 例，并计算得出：敏感度、特异度分别为88.89%、62.07%，提示miR-134 诊断脑卒中后认知功能障碍具有较好的灵敏度及特异度。

图2 miR-134的ROC曲线及曲线下面积

2.5 血清miR-134 表达水平与BDNF 的相关性分析PSCI 组患者血清BDNF 的表达水平为2.068（1.932，2.204），通过进行Spearman 相关分析，结果显示PSCI 患者血清miR-134 相对表达量与BDNF 水平呈现中度正相关（r = 0.734，P＜0.01）（图3）。

图3 miR-134表达水平与BDNF的相关性分析

3 讨论

据报告，国人PSCI 的发病率约为55.9%[7]，严重影响患者的生活质量，给家庭与社会带来沉重的负担。卒中后认知障碍是可以早期预防和治疗的疾病，因此，及早发现并对其进行针对性干预十分重要。血液生物学标志物的检测对于疾病的早期筛查有很大的帮助，研究证实[5,8]，miRNAs 在神经系统的分化与发育、突触可塑性的形成、学习记忆能力的维持等方面发挥着重要作用。我们前期研究发现[9]：血清miR-132 表达越高则卒中后越可能发生认知障碍。动物研究证明：miR-132 刺激[10]轴突生长，而miR-134 抑制[11-12]轴突生长。因此，探讨血清miR-134 表达和脑卒中后认知功能之间的关系有助于为卒中后认知障碍早期诊断、早期干预，为其提供更加准确的客观依据。

本研究，3 组对象的年龄、性别、受教育程度均相匹配。本研究发现PSCI 组血清miR-134 表达水平及血清BDNF 水平显著下降（P＜0.01），提示miR-134与PSCI 密切相关。miR-134是首次发现的树突microRNA，富集于大鼠海马神经元的神经元树突中，负性控制树突棘[13]的大小，miR-134 通过靶向Lim 结构域激酶1（LimK1）调节树突脊柱的发育，而LimK1被BDNF抑制[14]。Liu等人[15]发现miR -134 -5p 参与了血管性痴呆（VD）大鼠的认知功能障碍。此外，miR-134 还参与了sirt1 介导的CREB 和BDNF 表达调控，大鼠脑中Sirt1 缺乏导致miR-134 表达上调，未抑制的miR-134直接抑制CREB mRNA的翻译，导致CREB和BDNF 下调，使得突触可塑性和记忆功能受损[16]。Liu 等人[17]研究发现在大脑中动脉闭塞引起的认知功能障碍的大鼠脑中miR134升高，电针可降低大鼠海马区miR-134 的表达，从而负调控LimK1以增强突触树突可塑性，并认为miR-134 介导的LimK1 参与了电针诱导的海马突触可塑性，可以作为缺血性脑卒中恢复期改善学习、记忆能力的一个有利因素。由此推测PSCI 患者miR-134 的上调抑制了BDNF 的表达，导致患者认知功能障碍，提示血清可能是PSCI的危险标记物。本研究也发现，血清miR-134 水平与MoCA 评分呈正相关（P＜0.01）；此外，本研究构建了PSCI 诊断的ROC 曲线，曲线下面积为0.849（P＜0.01），显示其具有良好的应用价值，且敏感度、特异度分别为88.89%、62.07%，可作为PCSI 诊断的较好的血清学指标。或许，miR-134 可以作为脑卒中患者认知康复训练是否有效的血清学指标之一。

综上所述，通过测定PSCI 患者血清中miR-134 水平或许可以作为PSCI 患者认知功能及其变化的判断依据。但本研究也存在一定的局限性，今后将扩大样本量，分析不同阶段的PSCI 患者体miR-134 水平变化，或从细胞和动物层面深入探讨miR-134在神经退行性疾病中调控作用背后的分子机制，以进一步验证miR-134 作为PSCI生物学标记物的康复价值。