青藤碱调控Nrf2/Keap1信号通路对脓毒症急性肺损伤的改善作用

王慧 龚园其 周仪华 蓝海兵 张啸

南昌大学第二附属医院重症医学科（南昌 330000）

脓毒症是一种主要由细菌、病毒或真菌所引发全身炎症反应的疾病，是ICU 患者最常见的死亡病因之一［1］。该病常累及肺脏、肾脏等损伤，进而造成多器官出现功能障碍，这是其病死率居高不下的重要因素［2］。随着脓毒症加重，大量炎症介质释放，进而刺激中性粒细胞聚集与活化，导致肺泡内皮细胞受损、肺血管通透性增加，从而引起急性肺损伤［3］。所以脓毒症引起的急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是脓毒症最为常见的并发症。不同研究均观察到炎症反应与肺损伤的关联性极大，可见探讨脓毒症时将肺损伤作为观察多器官功能障碍的研究指标具有极高的研究价值［4］。青藤碱（Alkaloid sinomenine，SIN）是从青风藤提取分离出的一种具有较强生物活性的生物碱，现研究表明，青藤碱具有抗肿瘤、抗炎、镇痛等功效［5］。前文［6］研究证实盐酸青藤碱能够减轻脓毒症小鼠全身炎症反应，降低小鼠死亡率。但迄今青藤碱对脓毒症肺损伤的调控作用机制尚不明确。因此，本研究尝试建立大鼠脓毒症模型，按照脓毒症的定义，观察SIN 对脓毒症大鼠急性肺损伤的影响及对Nrf2/Keap1 信号通路的干预作用，为SIN 的抗炎作用进一步提供可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物60 只SPF 级SD 大鼠，雄性，6月龄，平均（180 ± 20）g（广州赛思思生物科技有限公司）。经南昌大学实验动物科学中心动物实验伦理审查通过（批准号：ACU18⁃392）

1.1.2 试剂SOD、MDA 含量检测试剂盒（产品货号：AK060、KTB1050，北京冬歌博业生物科技有限公司）；IL⁃1β、TNF⁃α、IL⁃6 试剂盒（产品货号：EK0445、EK0497、EK0499，上海和序生物科技有限公司）；甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶（GAPDH）、Nrf2、Keap1、HO⁃1及二抗均购自美国Cell Signaling Technology 中国公司。

1.2 实验方法

1.2.1 模型的建立及分组给药参照文献［7］采用盲肠结扎穿孔手术建立大鼠脓毒症ALI 模型。将60 只SD 大鼠随机分成ALI 组、假手术组、SIN 组（40⁃SIN 组、80⁃SIN 组、160⁃SIN 组），每组12 只。所有大鼠均以10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，约2～5 min 后检查大鼠麻醉程度后，将已彻底麻醉好的大鼠仰卧固定于操作台，清理腹部皮毛，碘酒消毒大鼠下腹并切约1.5 cm 切口，剪开腹膜，显露盲肠。然后，将盲肠1/3 处用缝合线结

扎后，用针头对穿结扎中部位置。完成后将盲肠收纳回腹腔，逐层关闭腹腔并进行消毒处理。假手术组大鼠在取出盲肠后不做结扎穿刺处理，暴露盲肠后直接将其回纳至腹腔内。SIN 组术后立即给予不同剂量（40、80、160 mg/kg）SIN 尾静脉注射给药，每天17：00～19：00 固定时间给药，连续3 d。

1.2.2 肺组织的采集末次给药结束后1 h，将大鼠麻醉处死，最大程度暴露胸腔且尽量避开肺脏及动脉，以免对肺组织病理切片的观察造成干扰以及之后指标的检测存在大量血渍，对各项指标的测定带来误差。

1.2.3 肺组织评分结果对取下来的大鼠肺脏进行脓毒症严重程度评分，评分标准参照参考文献［8］。评分要求双人同时评分，避免人为误差，取平均值进行最终计算。

1.2.4 HE 法检测大鼠肺组织病理损伤取出1.2.2 中左肺，进行常规透明、浸蜡、包埋后、切成厚度为5 μm 的切片后，脱蜡，水化，染色5 min，漂洗2 min，脱水2 min，透明处理，封片，置于显微镜下观察肺组织形态。

1.2.5 检测大鼠肺组织SOD、MDA 活性水平取另一部分的肺组织按要求制备肺组织匀浆液，以4 000 r/min 离心15 min，分离上清液，按照试剂盒说明书检测肺组织中SOD、MDA 活性水平。

1.2.6 ELISA 法检测大鼠肺组织IL⁃1β、TNF⁃α、IL⁃6 含量取1.2.2 中右肺组织置于4 ℃冰箱中解冻后，剪碎，制备组织匀浆液，检测其中IL⁃1β、TNF⁃α、IL⁃6 水平，具体操作说明书进行。

1.2.7 Western blot 法检测大鼠肺组织Nrf2、Ke⁃ap1、HO⁃1mRNA 蛋白表达取约0.5 g 肺组织制备成匀浆液，4 ℃离心，取上清液测定匀浆液蛋白总浓度。取适量上清液检测大鼠肺组织Nrf2、Keap1、HO⁃1 蛋白表达情况。

1.2.8 qRT⁃PCR 检测肺组织中Nrf2、Keap1、HO⁃1mRNA 的表达水平取0.4 mg 的肺组织，裂解提取总mRNA 并测定纯度。采用实时荧光定量法检测大鼠肺组织中Nrf2、Keap1、HO⁃1mRNA 相对表达量，各引物序列见表1。

表1 Nrf2、Keap1、HO⁃1mRNA 引物序列Tab.1 Primer sequences of Nrf2，Keap1 and ho⁃1mrna

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，所有数据以均值±标准差。多组间差异比较使用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 青藤碱对脓毒症急性肺损伤的肺组织评分的影响与假手术组对比，ALI 组肺组织评分增大（P<0.01）；与ALI 组对比，40⁃SIN、80⁃SIN、160⁃SIN组脓毒症急性肺损伤的肺组织评分减小（P<0.01），见表2和图1。

表2 青藤碱对脓毒症急性肺损伤的肺组织评分的影响Tab.2 Effect of sinomenine on lung tissue score of sepsis acute lung injury

图1 青藤碱对脓毒症急性肺损伤的肺组织评分的影响Fig.1 Effect of sinomenine on lung tissue score of sepsis acute lung injury

2.2 青藤碱对脓毒症急性肺损伤的肺组织氧化指标SOD、MDA 含量的影响与假手术组对比，ALI组肺组织氧化指标SOD 活性减弱，MDA 水平提高（P<0.01）；与ALI 组对比，40⁃SIN、80⁃SIN、160⁃SIN组肺组织氧化指标SOD 活性增强，MDA 水平降低（P<0.01），见表3和图2。

图2 青藤碱对脓毒症急性肺损伤的肺组织氧化指标SOD、MDA 含量的影响Fig.2 Effect of sinomenine on the content of SOD and MDA in lung tissue of sepsis acute lung injury

表3 青藤碱对脓毒症急性肺损伤的肺组织氧化指标SOD、MDA 含量的影响Tab.3 Effects of sinomenine on the contents of SOD and MDA in lung tissue of sepsis acute lung injury x±s

2.3 青藤碱对脓毒症急性肺损伤的肺组织IL⁃1β、TNF⁃α、IL⁃6 含量的影响与假手术组对比，ALI组肺组织IL⁃1β、TNF⁃α、IL⁃6 含量提高（P< 0.01）；与ALI 组对比，40⁃SIN、80⁃SIN、160⁃SIN 组肺组织IL⁃1β、TNF⁃α、IL⁃6 含量降低（P< 0.01），见表4和图3。

图3 青藤碱对脓毒症急性肺损伤的肺组织IL⁃1β、TNF⁃α、IL⁃6 含量的影响Fig.3 Effect of sinomenine on IL⁃1 in lung tissue of sepsis acute lung injury β，TNF⁃α，Effect of IL⁃6 content

表4 青藤碱对脓毒症急性肺损伤的肺组织IL⁃1β、TNF⁃α、IL⁃6 含量的影响Tab.4 Effects of sinomenine on IL⁃1 in lung tissue of sepsis acute lung injury β，TNF⁃α，Effect of IL⁃6 content x±s

2.4 大鼠肺组织病理切片假手术组大鼠出现少量淤血，但无明显的病理变化。ALI 组大鼠肺组织出现大量炎性细胞浸润，大面积的肺泡上皮水肿、变性，肺泡壁与肺泡间隔充血、水肿，气道管腔内炎性分泌物渗出。与ALI 组比较，40⁃SIN、80⁃SIN、160⁃SIN 组大鼠炎症程度减轻，但亦有少量巨噬细胞，肺间质水肿稍有，肺组织病理损伤得到了一定的缓解，且呈量⁃效关系，且高剂量组大鼠肺组织改善病变程度效果最佳，见图4。

图4 青藤碱对脓毒症急性肺损伤的肺组织HE 染色病理切片的影响（HE×200）Fig.4 Effect of sinomenine on he stained pathological sections of lung tissue in sepsis with acute lung injury（HE×200）

2.5 Western blot检测肺组织中Nrf2、Keap1、HO⁃1蛋白表达水平与假手术组对比，ALI 组大鼠肺组织中蛋白Nrf2、HO⁃1表达量明显减少（P<0.01），大鼠肺组织中蛋白Keap1表达量明显增大（P<0.01）。与ALI 组对比，40⁃SIN、80⁃SIN、160⁃SIN 组肺组织中Nrf2、HO⁃1表达量明显增大（P<0.01），大鼠肺组织中Keap1表达量显著减小（P<0.01），见表5和图5。

表5 青藤碱对脓毒症急性肺损伤的肺组织中Nrf2、Keap1、HO⁃1 蛋白表达水平Tab.5 Effects of sinomenine on Nrf2，Keap1 and HO⁃1 protein expression in lung tissue of sepsis acute lung injury x±s

图5 青藤碱对脓毒症急性肺损伤的肺组织中Nrf2、Keap1、HO⁃1、GAPDH 蛋白表达水平Fig.5 Effect of sinomenine on the expression levels of Nrf2，Keap1，HO⁃1 and GAPDH proteins in lung tissue of sepsis acute lung injury

2.6 qPCR 检测肺组织中Nrf2、Keap1、HO⁃1 mRNA表达水平与假手术组对比，显著下调ALI组大鼠肺组织中蛋白Nrf2、HO⁃1 mRNA 表达量明显减少（P<0.01），明显上调大鼠肺组织中蛋白Keap1 mRNA表达量明显增大（P<0.01）。与ALI组对比，40⁃SIN、80⁃SIN、160⁃SIN 组肺组织中Nrf2、HO⁃1 mRNA 表达量明显增大（P< 0.01），大鼠肺组织中Keap1mRNA 表达量明显减少（P<0.01），见表6。

表6 青藤碱对脓毒症急性肺损伤的肺组织中Nrf2、Keap1、HO⁃1 mRNA 表达水平Tab.6 Effects of sinomenine on the expression levels of Nrf2，Keap1 and HO⁃1 mRNA in lung tissue of sepsis acute lung injury ±s

表6 青藤碱对脓毒症急性肺损伤的肺组织中Nrf2、Keap1、HO⁃1 mRNA 表达水平Tab.6 Effects of sinomenine on the expression levels of Nrf2，Keap1 and HO⁃1 mRNA in lung tissue of sepsis acute lung injury ±s

组别假手术组ALI 组40⁃SIN 组80⁃SIN 组160⁃SIN 组给药剂量（mg/kg）--40 80 160 Nrf2 mRNA 0.98±0.05 0.54±0.04**0.73±0.05##0.89±0.06##1.35±0.08##Keap1 mRNA 0.97±0.06 5.12±0.25**4.51±0.21##2.59±0.18##2.34±0.19##HO⁃1 mRNA 1.04±0.1 0.23±0.03**1.09±0.08##1.79±0.12##2.26±0.12##

3 讨论

脓毒症极易发展成脓毒症急性肺损伤，其发病率为25%～45%；并且脓毒症合并ALI 患者在临床上死亡率可高达50%～60%［9］。青藤碱来源于青风藤，其源药材在《本草纲目》记载其“治风湿流注，历节鹤膝，麻痹瘙痒，损伤疮肿，入酒药中用”。故其对炎症的功效由来已久。青藤碱对LPS引起的大鼠脓毒症急性肺损伤具有一定的治疗作用［10］，但其治疗机制尚不明确。本文针对Nrf2/Keap1 信号通路进行探究，探究青藤碱对脓毒症引起的急性肺损伤的作用及其机制。

MDA 可以反应氧自由基的活性和数量，提示细胞损伤的程度［11］。SOD 是重要的抗氧化物质，具有抑制氧化应激反应、保护肺组织的作用［12］。IL⁃1β 和TNF⁃α 作为机体内最常见的促炎症因子，而IL⁃10 释放可抑制促炎症因子释放；TNF⁃α 能够引起炎症细胞聚集，合成并释放IL⁃1β，使IL⁃1β 参与炎症反应［13］，进而加剧炎症反应的进程，使炎症状况进一步恶化。肺部感染是脓毒症并发ALI 的危险因素之一［14］；而肺部感染首先会引起炎症的发生，进而伴随着氧化应激反应的发生。本研究结果表明，ALI 组大鼠肺脏指标SOD 活性减弱，MDA、IL⁃1β、TNF⁃α、IL⁃6 水平升高，切片结果出现大量炎性细胞浸润，大面积的肺泡上皮水肿、变性，肺泡壁与肺泡间隔充血、水肿，气道管腔内炎性分泌物渗出，这都反映了ALI 伴随着氧化应激过程以及炎症反应。而与ALI 组对比，青藤碱各组脓毒症急性肺损伤的肺组织评分减小并且肺组织氧化指标SOD 活性增强，MDA、IL⁃1β、TNF⁃α、IL⁃6 水平降低，这表明青藤碱可通过调节氧化应激水平及缓解炎症蔓延进程以缓解脓毒症急性肺损伤。

氧化应激反应与脓毒症急性肺损伤的发生、发展、转归密切相关，是机体内抗氧化应激主要通路之一为Nrf2/Keap1 信号通路。其中，Nrf2 激活后转移至细胞核，能转录编码各种抗氧化蛋白和代谢酶的基因，能抑制体内大部分的氧化应激反应［15］。作为Nrf2/Keap1信号通路下游靶基因，HO⁃1具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用［16］。Nrf2是氧化应激调控中的重要转录因子，调节抗氧化蛋白表达并抵抗氧化应激损伤［17］。本研究结果表明，青藤碱对脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织中明显上调Nrf2、HO⁃1蛋白及mRNA表达量，显著下调大鼠肺组织中Keap1 蛋白及mRNA 表达量，进而调节Nrf2/Keap1信号通路对脓毒症急性肺损伤有积极性改善。

综上所述，SIN 通过上调Nrf2、HO⁃1 蛋白及mRNA 表达量和下调大鼠肺组织中Keap1 蛋白及mRNA 表达量，进而调节Nrf2/Keap1 信号通路，进而缓解ALI 引起炎症浸润以及细胞组织损伤程度，保护肺组织，改善脓毒症引起的急性肺损伤。