茵陈蒿汤对肝癌原位移植瘤小鼠肝脏胆汁酸和肠道微生态的影响*

张玉梅 朱 琳 师 健 张春芳 张辰龙 郭凯航 王玉洁 李鹏飞

肝细胞癌(肝癌)是全球发病率极高的恶性肿瘤之一，发病率为4.7%，位居全球恶性肿瘤第6位，病死率8.3%，位于全球癌症第3位[1]。中国肝癌发病率和病死率均高于全球平均水平，疾病负担重。基于“肝脏-胆汁酸-肠道微生态轴”“肠-肝循环”概念，研究人员发现胆汁酸-肠道菌群生理病理相互影响，胆汁酸代谢障碍和肠道微生态之间的失衡参与了肝癌的发生发展[2]。茵陈蒿汤是《伤寒杂病论》中治疗湿热黄疸的著名方，具有保肝、利胆等功效。肝癌属于中医“黄疸”“肝积”“癥瘕”等范畴，在治疗肝癌的经典方剂中，该方使用频次位列前3[3]，临床效果明确但其作用机制尚不清楚。根据中医“肝与大肠相通”的理论及茵陈蒿提取物促进大鼠胆汁分泌的基础，笔者推测茵陈蒿汤可能通过平衡胆汁酸代谢-肠道微生态的关系进而控制肝癌的发生发展。

1 材料

1.1 实验动物SPF级别雄性 BABL/C 小鼠，30只，体质量18～22 g，购自厦门大学实验动物中心，许可证号：SYXK(闽)2018-0009。本实验符合厦门大学实验动物伦理委员会指导原则和要求，伦理号：XMULAC20200062。

1.2 药品与试剂茵陈蒿汤(茵陈蒿18 g，生大黄6 g，炒栀子6 g)，饮片购自厦门守一真源健康管理有限公司。将饮片于6倍量水中浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，药液浓缩至生药质量浓度分别为0.45 g/ml、0.9 g/ml、1.8 g/ml，4 ℃保存备用。16 S rDNA测序分析技术试剂盒：DNA试剂盒(批号：3302050)、DNA质检琼脂糖凝胶(批号：AD1200)、AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(批号：AP-GX-250)、qiagen粪便细菌DNA分离试剂盒(批号：51604)、DNA质检琼脂糖(批号：AN34L071)、TransStart Fastpfu DNA Polymerase(批号：JLC-R11648)、PCR建库试剂接头引物(批号：TD203)、上机前质检 qPCR Mix(批号：21612)、qPCR标准品(批号：GF-170F)、TruSeqTM DNA Sample Prep Kit(批号：NT0911-100)，以上均购自上海美吉生物医药科技有限公司。

1.3 仪器精密电子天平(Sartorius)，1290 Infinity series UHPLC System 超高液相色谱(Agilent)与Q Exactive Focus 质谱仪(Thermo Fisher Scientific)，MultiskanTMGO酶标仪(Thermo Fisher Scientific)，高速冷冻型离心机(DRAGONLAB)，Forma 8800型超低温冰箱(赛默飞世尔科技有限公司)。

2 方法

2.1 分组及建模将小鼠随机分为假手术组(SOG)、肝癌模型组(MG)、茵陈蒿汤高/中/低剂量组(HDG/MDG/LDG组)，每组6只。模型组和治疗组小鼠取浓度2×107个/ml H22肝癌细胞0.1 ml注于肝脏左叶建模，SOG组注入等量生理盐水。治疗组造模后24 h分别予1.8 g/ml、0.9 g/ml、0.45 g/ml茵陈蒿汤1 ml/log小鼠体质量灌胃，MG、SOG组给予等体积生理盐水，每日上午9:00～10:00给药1次，连续14 d。

2.2 样本收集末次给药24 h后，将小鼠颈椎脱臼处死，将完整肝脏称重，选取一部分用于HE染色，一部分用于胆汁酸分析。取盲肠末端的内容物置于液氮速冻，-80 ℃保存，用于肠道菌群多样性分析。

2.3 UHPLC-MS/MS分析①标本预处理：25 mg肝组织样品中加入1000 μl含0.1% 甲酸提取液(甲醇∶乙腈:水=2∶2∶1，含同位素标记内标)，涡旋混匀30 s；再加入钢珠，用35 Hz的频率研磨4 min，再于冰水浴超声5 min，重复步骤3 次。低温静置1 h后在4 ℃离心机中以1 2000 rpm离心15 min；取上清加至LC进样瓶中，用于UHPLC-MS/MS分析。②流动相条件：Agilent 1290 Infinity series (Agilent Technologies)超高效液相色谱仪，通过Waters ACQUITY UPLC BEH C18(150×2.1 mm,1.7 μm,Waters)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为1 mmol/L的乙酸铵和1 mmol/L的乙酸水溶液，B相为乙腈。柱温箱温度为60 ℃，样品盘设为4 ℃，进样体积为1 μl。③质谱条件：使用Q Exactive Focus高分辨质谱仪，以平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring,PRM)模式进行质谱分析。离子源参数如下：Spray voltage=3500/-3100 V,Sheath gas (N2) flow rate=40,Aux gas (N2) flow rate=15,Sweep gas (N2) flow rate =0,Aux gas (N2) temperature=350 ℃,Capillary temperature=320 ℃。

2.4 16SrDNA 测序分析菌群多样性使用DNA提取试剂盒对粪便标本进行细菌DNA提取。以菌群基因中的V3-V4区为靶标，以带有barcode的引物进行PCR扩增和纯化，得到样本PCR产物。使用荧光定量系统对PCR产物进行检测定量。构建Miseq文库，使用Illumina MiSeq PE 300平台进行Miseq测序，得到菌群V3-V4区的高通量数据。将Miseq测序得到的原始数据进行质量控制，采用PCA分析组间菌群差异、LEfSe分析优势菌属。

3 结果

3.1 小鼠肝重比较与SOG组比较，MG组肝重显著增加(P<0.01)；经茵陈蒿汤干预后，治疗组肝重显著减少且差异有统计学意义，其中高剂量效果最显著。表明茵陈蒿汤缩小了瘤体，可能具有一定抗肿瘤效果。见图1。

注：与SOG组比较，***P<0.001；与MG组比较，##P<0.01；与MG组比较，###P<0.001。图1 茵陈蒿汤对肝癌原位移植瘤小鼠肝脏重量的影响

3.2 HE染色SOG组未见肝癌组织，MG组见大片肝癌组织，且肝癌细胞核深染。LDG、MDG、HDG组均见肝癌组织部分坏死，并且肝癌组织细胞核染色较MG组浅。见图2。

图2 肝癌原位移植瘤小鼠肝组织病理(HE * 20 倍)

3.3 胆汁酸代谢差异性分析使用UHPLC-MS/MS分析肝组织中胆汁酸，可测出牛磺α鼠胆酸(T-α-MCA)、牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)、T-β-MCA、牛磺胆酸(TCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)等。其中各组TUDCA、TCA和TDCA差异均无统计学意义。MG组中T-α-MCA较SOG组显著降低(P<0.001)。与SOG组相比，MG组的初级结合胆汁酸T-β-MCA浓度显著降低(P<0.001)，而茵陈蒿汤治疗后逐渐升高(P<0.01)。说明茵陈蒿汤可能促进T-β-MCA的生成。见图3。

注：与SOG 组比较，***P<0.001；与 MG 组比较，##P<0.01；与 MG 组比较，###P<0.001。图3 茵陈蒿汤对肝癌原位移植瘤小鼠肝组织中胆汁酸的影响

3.4 肠道菌群属水平分析采用PCA分析不同组别小鼠菌群属水平的差异性。MG组与SOG组在空间图中距离较远，表明二者在属水平上的菌群物种差异有统计学意义。LDG、MDG、HDG组均与MG组距离较远，其中MDG组与HDG组在空间分布上显著与SOG组聚集，表明中高剂量的茵陈蒿汤在恢复肝癌小鼠属水平上的菌群失调可能有一定的作用。见图4。

图4 茵陈蒿汤对肝癌原位移植瘤小鼠肠道菌群 PCA 分析

3.5 优势菌种差异性分析采用LEfSe分析不同类群的相似性和优势菌种。SOG组中的优势菌属为乳酸杆菌科的乳酸杆菌属、小鼠杆菌科的小鼠杆菌属，MG组为螺旋杆菌科的螺旋杆菌属、毛螺菌科的毛螺菌属NK4A136和A2芽孢杆菌属，LDG组为脱硫弧菌科、毛螺菌科的毛螺菌属，MDG 组为拟杆菌科的拟杆菌属和另枝菌属，HDG组为颤螺菌属和梭状芽胞杆菌属。表明MG组和SOG组的优势菌属不同，而茵陈蒿汤治疗后可以改变优势菌属种类的构成，且不同剂量组具有差异性。

4 讨论

茵陈蒿汤对肝癌的治疗作用得到了临床的肯定，但是其机制尚未清晰。研究人员发现茵陈蒿汤可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路调控肝癌细胞增殖与凋亡[5]；茵陈提取物对人肝癌HepG2细胞增殖具有抑制作用，并促进细胞凋亡[5]；大黄中的大黄素通过miR-429/SOX2轴调控癌细胞增殖、迁移和侵袭[6]；栀子提取物可能通过下调肿瘤凋亡相关基因bcl-2表达诱导肝癌细胞凋亡[7]。本实验也证实茵陈蒿汤在体内可能存在抗肝癌的作用。

胆汁酸代谢异常参与了肠道微生态失衡及肝癌的发生发展。胆汁酸是胆固醇在肝细胞中经过一系列的生化反应所形成。鼠类肝细胞中主要合成胆酸和β-鼠胆酸，与牛磺酸结合为TCA和T-β-MCA被肝细胞排入胆管中。初级胆汁酸排放量减少会导致肠道潜在致病菌群增加从而影响肠道微生态。肝癌、肝硬化等慢性肝病过程中产生的初级胆汁酸减少，常伴随菌群的生态失调[8]。T-β-MCA可促进肝脏CXCR6+自然杀伤T细胞的选择性增加，发挥抗肿瘤作用[9]。本实验结果提示茵陈蒿汤可能促进T-β-MCA生成且高剂量效果更佳。

本研究发现，中高剂量的茵陈蒿可使肝癌小鼠的PCA评分与SOG组相近。SOG组中的优势菌属为乳酸杆菌属、小鼠杆菌属，属于正常菌属，具有促消化、提高肠道免疫、拮抗有害菌属繁殖等作用[10]。MG组中，随着T-β-MCA排泄减少，优势菌属变为螺旋杆菌属、毛螺菌属NK4A136和A2菌属等有害菌。螺旋杆菌可通过门静脉到达肝脏，激活肝癌细胞的Toll样受体2，活化肿瘤细胞中有丝分裂原蛋白激酶和NFκB，从而促进肿瘤细胞的增殖和浸润[11]。NK4A136被视为肝癌早期生物标志物[12]。LDG组中的优势菌属为脱硫弧菌科、毛螺菌科的毛螺菌属。脱硫弧菌被证明可能与肝纤维化有关，其产生的H2S气体对肠道上皮具有毒性作用[13]。MDG组中的优势菌属为拟杆菌属和另枝菌属。拟杆菌含有的胆盐水解酶可促进结合胆汁酸解离，因此可存活在较高浓度的T-β-MCA中。另枝菌属于革兰氏阴性菌，大部分耐胆汁[14]。拟杆菌和另枝菌属都能产生丙酸盐，门静脉内的丙酸盐水平增高可以减少炎症因子表达，抑制Th17细胞在肝脏中募集，从而抑制肝癌细胞增殖[14]。HDG 组中的优势菌属为梭状芽胞杆菌属和颤螺菌属。梭状芽孢杆菌属可产生乙酸盐、丙酸盐等[15]。颤螺菌属被视为下一代益生菌的候选者，能够产生丁酸盐[16]。丁酸盐可通过抑制Kupffer细胞中NF-κB的激活来抑制TNF-α、IL-6和髓过氧化物酶活性，从而减少肝脏损伤，甚至抑制肝癌进展[17]。综上所述，经茵陈蒿汤治疗后，各组优势菌种发生改变，且不同剂量组也存在差异性，这可能与随着药物浓度的增加初级胆汁酸排放量逐渐增加有关，不同优势菌在肝癌发展过程中发挥着不用作用。

综上所述，茵陈蒿汤可能通过促进初级结合胆汁酸 T-β-MCA 的合成，进而改变肠道优势菌种，从而发挥治疗肝癌的作用。