丹瓜方对HepG2细胞胰岛素抵抗模型LKB1-AMPK-ACC信号通路的影响*

杨柳清 李 亮 王思梅 黄苏萍 王志塔 衡先培△

胰岛素抵抗是糖脂代谢紊乱的中心环节，其中肝脏胰岛素抵抗最为关键。HepG2细胞来源于人肝胚胎瘤细胞，保留了正常肝细胞的基本生物特性，其表面表达高亲和力的胰岛素受体调控葡萄糖摄取、糖原合成酶的活性、脂类生成等[1]，能较理想地模拟体内葡萄糖代谢环境，是研究胰岛素抵抗的理想细胞模型。LKB1-AMPK-ACC信号通路在糖脂代谢中起着关键的调控作用。前期研究表明，痰瘀同治的丹瓜方，具有改善糖脂代谢、改善胰岛素抵抗，消除高糖的细胞毒性，恢复高糖中细胞生长的正常周期等作用[2-4]。本实验采用高糖高脂诱导培养HepG2细胞，建立胰岛素抵抗模型，予不同浓度的丹瓜方含药血清干预，并以二甲双胍含药血清作为阳性对照，探讨丹瓜方对LKB1-AMPK-ACC信号通路的影响。

1 材料

1.1 实验动物SPF级SD大鼠，雄性，12周龄，体质量：(220±10)g(购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证编号：SCXK(沪)2012-0002)。环境温度：(22±1)℃；湿度：50%±5%；12/12 h明暗周期。适应性普通饲料喂养1周，饮食、饮水、活动正常。

1.2 药物及试剂丹瓜方药液由丹参、瓜蒌、赤芍、薤白、法半夏、郁金、川芎等组成。制剂由福建中医药大学附属人民医院药剂科配制，批号：120928，每毫升含原生药含量3 g/ml。二甲双胍药液：上海信谊药厂有限公司，批号：国药准字H31022081。含药血清的制备：取健康雄性SD大鼠15只，随机分为丹瓜方组、二甲双胍组和空白组，分别以6.67 ml/kg丹瓜方药液、10 ml/kg二甲双胍药液及同体积生理盐水灌胃，于第8天处死，腹主动脉取血。HepG2细胞株(ATCC，USA)。双抗(Hyclone公司)。软脂酸(Sigma-Aldrich，USA)。牛血清白蛋白(不含脂肪酸)(北京索莱宝科技有限公司)。BCA蛋白定量试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)。预染蛋白(Marker Thermo，Scientific，USA)。PVDF膜转印膜(Merck Millipore)。牛血清白蛋白(北京索莱宝科技有限公司)。

1.3 主要实验仪器与设备倒置显微镜(TS-100F，日本尼康)。自动细胞计数仪(Countstar IC 1000，Countstar)。凝胶成像分析系统(721BR04812，BIORAD公司)。全自动酶标仪，ELX800，美国BioTek公司。凝胶成像分析系统，721BR04812，BIORAD公司。

2 方法

2.1 HepG2细胞的培养将HepG2细胞冻存管37 ℃水浴并融化，将冻存细胞悬液转移至含新鲜完全培养液的离心管，吹打成细胞悬液后，离心，弃上清，加入培养液重悬，吸取悬液至培养瓶内，置于恒温培养箱中培养，次日换液，并观察细胞贴壁情况。当细胞贴壁至80%～90%时传代，倒置显微镜观察，当细胞间隙增大、回缩近圆形且开始脱落时，转移细胞悬液于离心管中，离心5 min后弃去上清，加新鲜的培养液并吹打成细胞悬液，按1∶3传代至含新鲜培养液的培养瓶中，置于培养箱中培养。取对数生长期细胞用于实验。

2.2 HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立及模型鉴定

根据前期的实验基础[5,6]，本实验利用0.25 mmol/L PA浓度与4 g/L糖浓度共同体外培养诱导HepG2细胞24 h后成功建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型。用葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖摄取能力鉴定HepG2细胞胰岛素抵抗模型。

2.3 含药血清实验浓度的筛选将HepG2细胞用胰酶消化后，置于培养箱内培养。待细胞贴壁后，更换无血清培养液继续培养12 h，加入不同浓度的丹瓜方含药血清、二甲双胍含药血清和空白血清(2.5%，5%，10%，15%)分别干预12 h、24 h、36 h、48 h。与完全培养基组做对照，完全培养基组培养液为89%低糖DMEM培养液、10%FBS和1%双抗。用酶标仪测量各孔的吸光值。细胞活力(%)=(实验组OD-空白组OD)/(完全培养基组OD-空白组OD)×100%。筛选出本实验各含药血清干预HepG2细胞的适合浓度和适合作用时间。

2.4 实验分组根据2.3实验结合分组如下：正常组：HepG2细胞+5%空白血清；溶剂组：HepG2细胞+溶剂溶液+5%空白血清；模型组：HepG2细胞+诱导液+5%空白血清；二甲双胍组：HepG2细胞+诱导液+5%二甲双胍含药血清；5%丹瓜方组：HepG2细胞+诱导液+5%丹瓜方含药血清；10%丹瓜方组：HepG2细胞+诱导液+10%丹瓜方含药血清。每组设3个复孔。

2.5 检测指标及方法

2.5.1 测定各组葡萄糖消耗量及计算胰岛素敏感性指数用葡萄糖氧化酶法检测上清液中葡萄糖残留量。在酶标仪上测定各孔吸光度，比较各组残存糖浓度，计算出各组糖耗量和胰岛素敏感性指数。根据参考文献[7]，胰岛素敏感性指数(%)=(葡萄糖消耗量实验组胰岛素+-葡萄糖消耗量实验组胰岛素-)/(葡萄糖消耗量正常组胰岛素+-葡萄糖消耗量正常组胰岛素-) ×100%。

2.5.2 测定各组三酰甘油(TG)按上述2.4实验分组加入含0.25 mmol/L PA与不同含药血清的培养基诱导干预24 h后，用三酰甘油测试盒测定TG含量。

2.5.3 Western blot检测蛋白表达各组LKB1 P-AMPK AMPK P-ACC ACC蛋白表达药物干预24 h后的HepG2细胞用细胞裂解液裂解后提取总蛋白，检测蛋白浓度。取等量蛋白样品40 μg，最后加预染蛋白Marker 5 μl。经缓冲液处理、蛋白变性、SDS-PAGE胶电泳分离后，将蛋白转移至PVDF膜上，用凝胶成像系统进行蛋白条带显影及储存。

3 结果

3.1 不同浓度大鼠血清对HepG2细胞活力影响10%空白血清、丹瓜方含药血清和二甲双胍含药血清干预36 h、48 h细胞存活率显著降低(P<0.01)，12 h、24 h细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05)；15%、20%空白血清、丹瓜方含药血清和二甲双胍含药血清干预12 h、24 h、36 h、48 h细胞存活率均显著降低(P<0.01)。考虑干预后效果的明显度，选用5%丹瓜方含药血清作为干预浓度，10%丹瓜方含药血清作为梯度对比浓度。见表1～表3。

表1 各组小鼠不同浓度空白血清对HepG2细胞生长活性影响比较

表2 各组小鼠不同浓度丹瓜方含药血清对HepG2细胞生长活性影响比较

表3 各组小鼠不同浓度二甲双胍含药血清对HepG2细胞生长活性影响比较

3.2 各组含药血清对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗量 胰岛素敏感指数 TG含量影响模型组不含胰岛素与含胰岛素的糖耗量、胰岛素敏感指数明显下降(P<0.01)，TG含量明显升高(P<0.01)。与模型组相比，二甲双胍组，5%丹瓜方组、10%丹瓜方组不含胰岛素与含胰岛素的糖耗量、胰岛素敏感指数明显升高(P<0.01)，TG含量明显下降(P<0.01)。与二甲双胍组比较，5%丹瓜方组含胰岛素的糖耗量、胰岛素敏感性指数下降(P<0.05)，5%丹瓜方组不含胰岛素的糖耗量、TG含量差异无统计学意义(P>0.05)；10%丹瓜方组不含胰岛素与含胰岛素的糖耗量、胰岛素敏感性指数、TG含量差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各组小鼠含药血清对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗量 胰岛素敏感指数 TG含量影响比较

3.3 含药血清对胰岛素抵抗HepG2细胞中LKB1 P-AMPKα AMPKα P-ACC ACC蛋白表达影响与正常组相比，模型组LKB1、AMPKα、P-AMPKα、P-ACC蛋白表达降低(P<0.01)，ACC蛋白表达增多(P<0.01)；与模型组相比，二甲双胍组、5%丹瓜方组、10%丹瓜方组LKB1、P-AMPKα、P-ACC蛋白表达增加(P<0.01)，ACC蛋白表达降低(P<0.01)，AMPKα蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

注：与正常组比较，**P<0.01;与模型组比较，#P<0.05；##P<0.01。图1 含药血清对胰岛素抵抗HepG2细胞中LKB1 P-AMPKα AMPKα P-ACC ACC蛋白表达影响

4 讨论

胰岛素抵抗是2型糖尿病、肥胖和动脉粥样硬化等临床疾病的共同危险因素。LKB1-AMPK-ACC信号通路与胰岛素抵抗密切相关。AMPK是一种重要的蛋白激酶，是调节细胞能量代谢的感受器，最重要的功能是调节葡萄糖和脂肪代谢，它可以增强胰岛素的敏感性，减少肝糖的输出[8]。研究发现，AMPK基因剔除可诱导小鼠胰岛素抵抗，AMPK过表达或AMPK特异性激活剂均具有胰岛素增敏效应[9]。LKB1是AMPK的上游激酶之一[10]，研究证实肝细胞中的LKB1有助于磷酸化AMPK，LKB1缺失可使AMPK功能下调。这说明在糖异生过程中，LKB1是AMPK信号通路的一个关键的靶分子，诱导的LKB1能够通过控制AMPK在组织中的表达影响AMPK下游的通路。ACC是AMPK的下游靶点之一，是脂肪酸合成的限速酶，AMPKα的磷酸化对ACC活性的调节起重要作用，AMPKα的活化促进ACC磷酸化，从而抑制ACC，ACC被AMPK磷酸化后失去活性，增强了脂肪酸氧化作用，使脂肪酸及TG合成减少，因此，细胞内ACC磷酸化水平上调则被作为AMPKα活化的标志[11-13]。因此本研究以LKB1-AMPK-ACC信号通路为切入点，探讨丹瓜方改善糖脂代谢和胰岛素抵抗的机制。

本实验结果表明与正常组相比，模型组LKB1、AMPKα、P-AMPKα、P-ACC蛋白表达明显降低(P<0.01)，ACC蛋白表达显著增多(P<0.01)，提示LKB1-AMPK-ACC信号通路在HepG2细胞胰岛素抵抗模型表达异常，进而影响葡萄糖和脂肪的代谢。二甲双胍是临床上常用的降糖药物，研究表明，二甲双胍调节糖脂代谢的分子机制与AMPK信号通路密切相关。二甲双胍通过LKB1显著增加AMPKα1亚基的磷酸化。文献报道在LKB1基因敲除高脂饮食胰岛素抵抗的小鼠中，二甲双胍不降低血糖[10]，说明二甲双胍通过激活LKB1-AMPK信号通路，使AMPK磷酸化，参与多个体内能量代谢途径，包括后续使ACC磷酸化后失活而促进脂肪酸氧化，减少脂肪的合成[14，15]，继而抑制肝脏的糖异生，改善胰岛素敏感性，降低血糖水平[16]。本实验结果显示，5%丹瓜方组、10%丹瓜方组与二甲双胍组相比，LKB1、P-AMPKα、P-ACC、ACC蛋白表达差异无统计学意义。提示丹瓜方显著增加LKB1、P-AMPKα蛋白的表达，上调ACC的磷酸化水平，抑制ACC蛋白的表达，丹瓜方改善胰岛素的敏感性的机制与二甲双胍相似，都与调控LKB1-AMPK-ACC信号通路有关。

中医认为痰浊、瘀血既是胰岛素抵抗的病理产物，也是进一步导致“变证”“坏证”的病因。因此，解决痰瘀互结对改善胰岛素抵抗有着至关重要的作用。丹瓜方是基于痰瘀互结的基本病机，立足于痰瘀同治的方剂。本研究结果表明，丹瓜方含药血清可以增加高糖高脂诱导的HepG2细胞抵抗模型的葡萄糖摄取能力，改善胰岛素敏感指数，降低细胞内TG含量，其中10%丹瓜方组与二甲双胍组作用效果相当，优于5%丹瓜方组。由此可以看出，以活血化瘀祛痰之法组成丹瓜方复方，其作用相互协同，共同起到增加葡萄糖消耗量，提高胰岛素敏感性，降低细胞内TG沉积，从而起到改善胰岛素抵抗的作用，且其作用存在剂量依赖关系。

综上所述，丹瓜方可改善HepG2胰岛素抵抗模型细胞糖脂代谢和胰岛素抵抗，其调控的糖脂代谢的分子机制为调控LKB1-AMPK-ACC信号通路。但是丹瓜方调控LKB1-AMPK-ACC信号通路的机制尚未完全阐明，有待进一步的深入研究。