妊娠期再发性念珠菌性阴道炎患者的阴道菌群多样性研究

唐莉 隗伏冰 隗洪进 刘珮瑜 伞翠平 钟文彬 刘玉华 郭海珊

外阴阴道假丝酵母菌病（Vulvovaginal candidiasis，VVC）也称念珠菌性阴道炎，为最常见外阴阴道感染性疾病之一，据统计［1］，75%妇女一生中至少患过1 次VVC，6%～9%妇女患有复发性VVC（1年内有症状并经真菌学证实发作4 次或以上），而1年内发作次数不足4 次，不能诊断为复发性VVC 者，定义为VVC 再发［2］。基于16S rDNA 的测序是近年来微生态领域最具突破性的技术，它提供丰富的全局性物种类群信息，可在微生物集群的层面揭示它们之间的相互作用［3］。本文采用16S rDNA 测序法分析妊娠期再发性VVC 患者的阴道细菌多样性，与妊娠期单纯性VVC 患者和健康孕妇的阴道菌群结果进行比较，揭示菌群结构改变与VVC 发生发展的相互关系。

1 对象与方法

1.1 对象

选取2018年11月至2019年8月期间在东莞市妇幼保健院首次确诊为妊娠期VVC 患者36 例和健康孕妇20 例。动态采集36 例妊娠期VVC 患者3 个时间点的阴道分泌物（Y）：Y1 为VVC 治疗前，Y2 为治疗结束后7日，Y3 对于再发患者为首次再发时采集（孕24 周内），对于未再发患者为孕24 周左右采集，如Y2 镜检见真菌，Y3 于重复治疗7日后采集。根据患者3 个时间点的阴道分泌物镜检结果将妊娠期VVC 患者分为A 组未再发组（9 例）、B 组再发组（14 例）、C 组持续阳性组（13例）。因此，AY1 表示A 组第1 个时间点的所有阴道分泌物，以此类推AY2、AY3、BY1、BY2、BY3、CY1、CY2、CY3。

妊娠期VVC 患者纳入标准：①年龄20～40 岁，孕周＜12 周；②临床症状为外阴瘙痒、灼痛，白带增多等；③体征为外阴潮红、水肿，阴道内见较多白色豆渣样或凝乳样分泌物；④实验室镜检发现念珠菌菌丝或培养有念珠菌生长。排除标准：①复发性VVC；②其它阴道炎如细菌性阴道病、滴虫性阴道炎等；③对治疗药物过敏；④排除糖尿病、免疫系统性疾病、恶性肿瘤等各种急慢性疾病。研究期间剔除标准：①随访期间出现流产或失访者；②入组患者治疗后镜检真菌阳性，重复治疗镜检真菌转为阴性者。本研究治疗使用克霉唑0.5 g（德国拜耳制药）单次阴道用药。研究对象知情同意，研究经院伦理委员会批准同意。

1.2 标本收集

动态采集妊娠期VVC 患者3 个时间点的阴道分泌物（Y）。患者采取膀胱截石位，研究者使用一次性无菌窥阴器撑开阴道，用3 根一次性无菌阴道拭子分别于阴道壁中下1/3 处轻轻旋转至少10次，保证样本量充足，然后将其放入含有3 mL 保存液的试管中充分涮洗，室温下放置1 周内转运至实验室提取阴道分泌物基因组DNA。

1.3 基因组DNA 提取

含阴道分泌物的保存液转移至2 mL 离心管中高速离心，去除上清液。加入250 μL Buffer ATL、250 μL Buffer AL 和20 μL Proteinase K 至样本中，颠倒或涡旋混匀，65℃水浴15～30 min。按照TIANamp Stool DNA Kit（天根生化科技有限公司）说明书操作提取DNA。

1.4 16S rDNA 高通量测序

将提取到的总DNA 作为模板，并且对其细菌16S rDNA V3 区片段进行PCR 扩增。PCR 反应条件：98℃变性2 min，35 个循环为94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s。扩增产物使用Agencourt AMPure XP kit（贝克曼库尔特有限公司）进行纯化，然后在晶芯BioelectronSeq4000 基因测序仪（北京博奥晶典生物技术有限公司）上进行高通量测序。

1.5 测序数据分析

测序下机数据使用QIIME2［4］软件（version 2019.10.0）进行处理。首先，使用q2-cutadapt 去除PCR 引物序列。然后，使用quality-filter 对数据质量进行质控并过滤和使用deblur 进行数据降噪。接着，使用vsearch 按97%相似性进行操作单元（operational taxonomic units，OTUs）分析。代表OUT 序列依据Greengenes 数据库（v13_8）应用feature-classifier 进行物种注释。最后，使用Kruskal-Wallis 检验分析组间差异菌属。

1.6 统计分析

应用R 软件进行统计分析；计数资料采用（%）表示；计量资料采用Kruskal-Wallis 检验进行比较分析；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高通量测序结果

共完成128 个样品测序，获得63 731 465 条Reads，每个样品平均497 902 条Reads，最少的样本为25 418 条Reads。QIIME2 软件注释结果显示，分别在A 组未再发组、B 组再发组、C 组持续阳性组和N 组健康孕妇组中鉴定出542、572、572、418 条OTUs。见图1。

图1 不同组间OTUs 的韦恩图Figure 1 Venn diagram of OTUs among different groups

2.2 细菌Alpha 多样性分析

随着取样量的增加，各分组中的菌群OTU 趋于稳定，提示测序量较合理，见图2。各分组及采样点之间的Alpha 多样性比较，差异无统计学意义（所有分组Kruskal-Wallis p-value=0.45；pairwise Kruskal-Wallis q-value 均大于0.05），见图3。

图2 不同分组的稀释曲线图Figure 2 Dilution curves of different groups

图3 不同分组及时间点的Alpha 多样性（Shannon 指数）分布Figure 3 Alpha diversity（Shannon index）distribution for different groups and time points

2.3 物种注释结果

在门水平上，共发现11 个门。A 组未再发组、B 组再发组、C 组持续阳性组、N 组健康孕妇组均以厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门占主要比例，分别位列前三位。在属水平上，共发现132 个属。A组未再发组中占比超过0.5%的主要属类，依次为乳杆菌属64.12%、双岐杆菌属6.44%、普雷沃菌属4.48%、巨球型菌属0.72%和小杆菌属0.54%。B 组再发组中依次为乳杆菌属70.50%、链球菌属8.56%、小杆菌属2.02%、普雷沃菌属0.66%和双岐杆菌属0.66%。C 组持续阳性组中依次为乳杆菌属69.53%、普雷沃菌属5.79%、链球菌属1.00%和小杆菌属0.65%。N 组健康孕妇组中依次为乳杆菌属59.73%、双岐杆菌属11.32%和普雷沃菌属1.46%。见图4。

图4 不同分组的细菌门和属水平物种组成Figure 4 The horizontal species composition of the bacterial phylaand genera in different groups

2.4 差异菌属分析

所有的样本前三个主要优势菌门分别为厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门，通过聚类分析可以分为两大类，其中第一类以厚壁菌门为主要优势菌，占75.2%（94/125），而第二类以放线菌门为主要优势菌，占24.8%（31/125），见图5、图6。通过主成分分析，可知前两个组分的解释度为99.89%。由于第二类阴道细菌谱的样本在每个分组中的样本例数较少，未能进行有效的统计检验，因此，本文主要讨论第一类样本。

图6 两类样本间菌群丰度比较Figure 6 Comparison of bacterial abundance between 2 groups

在第一类的94 个样本中，通过在属水平的组间对比分析，发现差异菌属。在治疗前，AY1 与N组健康孕妇组比较，丙酸杆菌属和韦荣氏球菌属丰度显著增加，劳尔氏菌属的丰度显著降低；BY1 与N 组健康孕妇组比较，普雷沃菌属、放线菌属、弯曲杆菌属和嗜胨菌属丰度显著降低；CY1 与N 组健康孕妇组比较，韦荣氏球菌属、孪生球菌属和小杆菌属的丰度显著增加，双歧杆菌属丰度显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。在未再发组中，AY3 与N 组健康孕妇组比较，巨球型菌属丰度显著增加，丙酸杆菌属丰度显著增加，与AY1 类似；在再发组中，BY3与健康孕妇组（N 组）比较，普雷沃菌属、棒杆菌属、嗜胨菌属、Finegoldia、Anaerococcus、弯曲杆菌属、卟啉单胞菌属显著降低；在持续阳性组中，CY3 与N组健康孕妇组比较，韦荣氏球菌属丰度显著下降，双歧杆菌属丰度也下降，差异无统计学意义（P＞0.05），考虑个别样本差异因素。见表1。乳杆菌属主要包括卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌及其他乳杆菌。N 组健康孕妇组以卷曲乳杆菌为优势菌，三组妊娠期VVC患者均以惰性乳杆菌为优势菌。见表2。

表1 差异菌属分析（±s）Table 1 Analysis of Different Bacteria（±s）

表1 差异菌属分析（±s）Table 1 Analysis of Different Bacteria（±s）

分组对比AY1 vs N H BY1 vs N CY1 vs N AY3 vs N BY3 vs N CY3 vs N菌属丙酸杆菌属韦荣氏球菌属劳尔氏菌属普雷沃菌属放线菌属弯曲杆菌属嗜胨菌属韦荣氏球菌属双歧杆菌属孪生球菌属小杆菌属巨球型菌属丙酸杆菌属普雷沃菌属棒杆菌属嗜胨菌属Finegoldia Anaerococcus弯曲杆菌属卟啉单胞菌属韦荣氏球菌属双歧杆菌属第一类（1.64×10-5）±（1.71×10-5）（3.93×10-6）±（9.60×10-6）（2.12×10-6）±（4.39×10-6）（4.17×10-5）±（8.30×10-5）0.00±0.00 0.00±0.00（8.52×10-6）±（2.08×10-5）（6.21×10-3）±（1.39×10-2）（5.28×10-3）±（1.79×10-2）（2.16×10-3）±（4.94×10-3）（1.09×10-2）±（1.16×10-2）（2.02×10-2）±（6.02×10-2）（1.47×10-4）±（4.25×10-4）（1.66×10-2）±（4.43×10-2）（3.66×10-6）±（1.42×10-5）（5.97×10-6）±（1.46×10-5）（1.11×10-5）±（3.33×10-5）（3.43×10-7）±（1.33×10-6）（1.26×10-6）±（4.88×10-6）0.00±0.00（9.33×10-4）±（2.21×10-3）（7.52×10-3）±（2.58×10-2）第二类（5.53×10-6）±（1.76×10-5）0.00±0.00 0.00±0.00（1.57×10-2）±（4.30×10-2）（1.75×10-4）±（6.70×10-4）（7.90×10-5）±（1.47×10-4）（1.01×10-4）±（1.42×10-4）0.00±0.00（5.16×10-2）±（2.23×10-1）0.00±0.00（1.34×10-3）±（4.10×10-3）（1.17×10-6）±（5.24×10-6）（5.53×10-6）±（1.76×10-5）（1.57×10-2）±（4.30×10-2）（2.74×10-4）±（6.32×10-4）（1.01×10-4）±（1.42×10-4）（6.98×10-5）±（1.15×10-4）（6.95×10-5）±（1.35×10-4）（7.90×10-5）±（1.47×10-4）（4.69×10-5）±（1.15×10-4）0.00±0.00（5.16×10-2）±（2.23×10-1）6.0 272 5.1 852 5.1 852 10.0 050 6.0 350 5.1 059 4.9 818 8.0 328 6.1 947 5.8 263 4.0 624 4.9 012 4.8 399 8.2 417 7.0 358 6.9 751 5.8 437 3.9 988 3.9 988 3.9 507 5.8 263 0.3 560 P 值0.0 141 0.0 228 0.0 228 0.0 016 0.0 140 0.0 238 0.0 256 0.0 046 0.0 128 0.0 158 0.0 438 0.0 268 0.0 278 0.0 041 0.0 080 0.0 083 0.0 156 0.0 455 0.0 455 0.0 469 0.0 158 0.5 507

表2 不同分组间乳杆菌种属丰度对比（±s）Table 2 Comparison of abundance of Lactobacillus species among different groups（±s）

表2 不同分组间乳杆菌种属丰度对比（±s）Table 2 Comparison of abundance of Lactobacillus species among different groups（±s）

分组与N 组对比H P 值N AY1 BY1 CY1 AY3 BY3 CY3菌属惰性乳杆菌卷曲乳杆菌其他乳杆菌惰性乳杆菌卷曲乳杆菌其他乳杆菌惰性乳杆菌卷曲乳杆菌其他乳杆菌惰性乳杆菌卷曲乳杆菌其他乳杆菌惰性乳杆菌卷曲乳杆菌其他乳杆菌惰性乳杆菌卷曲乳杆菌其他乳杆菌惰性乳杆菌卷曲乳杆菌其他乳杆菌丰度（2.63×10-1）±（4.24×10-1）（3.87×10-1）±（4.24×10-1）（2.40×10-4）±（4.63×10-4）（5.74×10-1）±（5.00×10-1）（1.80×10-1）±（3.69×10-1）（1.01×10-3）±（1.89×10-3）（4.89×10-1）±（4.81×10-1）（2.47×10-1）±（4.29×10-1）（4.17×10-4）±（5.12×10-4）（4.84×10-1）±（4.45×10-1）（1.61×10-1）±（3.48×10-1）（1.05×10-3）±（1.20×10-3）（4.29×10-1）±（4.34×10-1）（2.33×10-1）±（3.73×10-1）（1.32×10-3）±（3.21×10-3）（5.08×10-1）±（4.41×10-1）（1.73×10-1）±（3.43×10-1）（4.51×10-4）±（6.41×10-4）（5.39×10-1）±（4.60×10-1）（1.47×10-1）±（3.15×10-1）（6.99×10-4）±（6.78×10-4）3.1 812 3.9 379 3.6 732 3.9 845 0.8 021 0.3 704 2.5 756 1.2 429 3.9 169 0.9 934 1.7 531 3.9 169 1.7 750 1.2 429 3.9 169 1.7 948 1.4 338 3.9 169 0.0 745 0.0 472 0.0 553 0.0 459 0.3 705 0.1 749 0.1 085 0.2 649 0.0 478 0.3 189 0.1 855 0.1 844 0.1 828 0.1 712 0.1 058 0.1 803 0.2 311 0.0 478

3 讨论

女性阴道微生态是由阴道微生物、内分泌系统、阴道解剖结构及阴道局部免疫系统共同组成的生态系统［5］。本研究通过16s rDNA 测序技术在妊娠期VVC 患者阴道细菌门水平发现，厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门为主要优势菌门，进一步在属水平探讨占比最大的乳杆菌属。乳杆菌属归类于厚壁菌门，不少学者发现乳杆菌属中的多个菌种对维持阴道微生态具有重要作用［6-7］，其中卷曲乳杆菌具有抑真菌作用，而惰性乳杆菌则可能影响真菌治愈［8-9］，这两种菌在本研究中为健康孕妇及患病孕妇的差异菌。

本研究发现阴道细菌中除了有大量的乳酸杆菌外，还存在一定多样性的细菌菌落，这些细菌丰度的改变可能与念珠菌阴道炎的发生、发展以及预后相关。本研究在C 组持续感染组中发现双歧杆菌丰度的大幅度减少，在C 组持续感染组的Y1时间点中，双歧杆菌属的丰度从5%下降到0.5%，而在Y3 时间点中，丰度仍维持在0.7%。双岐杆菌属于生理性有益菌，具有生物屏障、营养作用、抗肿瘤作用、免疫增强作用、改善胃肠道功能、抗衰老等多种重要的生理功能［10］。双岐杆菌与乳杆菌类似，能够抑制有害细菌的生长，抵抗病原菌的感染，其产生的醋酸、丙酸、丁酸及乳酸等有机酸对于维持阴道PH 值也是非常重要［11-12］。此外，在B组再发组中发现普雷沃菌属在Y1 时间点中，其丰度较健康孕妇降低，从1.5%下降到0.4%，而在再发阶段（Y3 时间点），仍然显著下降。由于BY3 中有一个样本的普雷沃菌为15%。排除该样本后，BY3 中的平均丰度为0.7%。因此，普雷沃菌属在再发组中是显著下降的。普雷沃菌属是近年来从类杆菌属中分出的一个新菌属，主要聚集于正常人体的口腔、女性生殖道等部位，组成这些部位的正常菌群，是常见的条件致病菌之一［13］，其主要产物是乙酸和琥珀酸及少量的异丁酸、异戊酸和乳酸，健康条件下对阴道PH 值有调节作用［14］。

综上所述，本研究发现妊娠期再发性念珠菌性阴道炎患者及健康孕妇阴道中存在一定多样性的细菌群，其中卷曲乳杆菌及惰性乳杆菌为较显著差异菌。此外，还发现双歧杆菌属和普雷沃菌属等差异菌属，提示这些菌属丰度的改变可能与疾病的预后有关，或许可以作为治疗妊娠期VVC的预后预测指标及个性化治疗的靶标位点，但其对疾病预后的作用及机制仍需要探索。