Nugent评分方法技术改良及在细菌性阴道病诊断中的应用评价

牛婧 李娇 李娜 孙婧 张静 王亚文

细菌性阴道病（Bacterial vaginosis，BV）是由加德纳菌、厌氧菌等增多，乳酸杆菌减少，阴道生态系统改变而引起的阴道感染性疾病［1］。BV 是育龄期女性中最常见的阴道感染性疾病之一［2］，有研究表明其感染率在20%～60%［3］，且BV 患者中约50%无临床症状表现［4］。BV 可诱发多种妇科疾病，如尿道炎、其他类型的阴道炎、子宫内膜炎、妇科肿瘤［5］，也可导致多种产科疾病，如早产、羊膜炎、羊水感染、绒毛膜炎、新生儿感染等［6-7］。另外由于BV 与其他性传播疾病，如人类免疫缺陷病毒、单传疱疹病毒Ⅱ型、沙眼衣原体和淋病奈瑟菌的感染有关［8-9］，BV 已成为全球关注的主要问题。因此，对BV 早诊断、早治疗对女性生殖道健康具有非常重要的意义。在诊断BV 的实验室方法中以Nugent 革兰染色评分方法作为诊断和疗效观察的金标准［10］。但Nugent 评分方法缺乏标准化的分析前条件，传统方法为使用无菌阴道窥器暴露阴道，使用无菌棉拭子拭取阴道内侧分泌物从左至右在载玻片上涂片后送检。因为不同的操作者在阴道分泌物的采样量、均匀性和涂布厚度均没有质量控制，在没有涂片标准要求下的采样结果其差异非常大，严重影响了诊断其结果的一致性和准确性［11］。因此，本研究旨在建立Nugent 评分前的样本采集与涂布的标准化质量规范，以提高BV 诊断的准确性，并对改良方法进行评价。

1 材料与方法

1.1 研究对象

随机选取2018年5月至2018年8月在西安交通大学第一附属医院妇科门诊就诊的10 例女性作为研究对象进行改良方法的建立实验，233 例研究对象进行改良方法和传统方法的比较和评价实验。纳入标准：①符合阴道微生态评价的临床应用专家共识［12］；②就诊24 h 内无性生活史、阴道上药史、阴道灌洗史；③对本研究签署知情同意书。排除标准：①月经期妇女；②合并精神疾病，不能判断自身症状者。本研究经院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂

分析天平（生产厂家：赛多利思；型号：BSA224S-SW；精密度0.000 1 g）、显微镜（生产厂家：奥林巴斯；型号：C31）、革兰氏染色液（生产厂家：珠海贝索生物技术有限公司；批号：C210801；规格：龙胆紫液×250 mL、碘溶液×250 mL、脱色液×250 mL、沙黄溶液×250 mL）、量勺、一次性无菌棉拭子、载玻片、涂布棒。

1.3 Nugent 评分方法分析前技术改良方法的建立与评价

1.3.1 涂片范围的设计

在（76×26）mm 的载玻片上分别选择（10×10，20×20，20×30）mm，设计涂片范围，并用划线笔进行确定，选择涂片面积大小易于涂布操作及镜下观察。

1.3.2 阴道分泌物取样量的设计

①选取10 位患者，由医生取足量的阴道分泌物，分别使用预制量勺取样称重，取样量分别为半勺、一平勺、两平勺，每个样本同一体积取样三次，分别使用分析天平进行称重，计算均数（X）、标准差（SD）和变异系数（CV），测算取样最佳重量。②使用涂布棒，分别将这30 个样本按三种体积、三种面积，在载玻片上进行均匀涂片。③将这30 个样本进行革兰染色后在显微镜油镜下进行观察，认为镜下细菌分布均匀无聚集时为涂片薄厚合适，选择薄厚合适的取样量作为改良方法的阴道分泌物取样量。

1.4 改良方法与传统方法的比较

1.4.1 比较结果判读方法

233 例研究对象分别使用传统方法（将阴道分泌物从左至右进行涂片）及改良方法（采用标准的涂片量及标准的涂片范围进行涂片），镜下分别观察菌群密集度、多样性、Nugent 评分结果及BV 诊断结果并记录，比较两组结果的差异性。分别对传统方法和改良方法的菌群密集度和菌群多样性的镜检结果进行数值化，以“+”为1、“++”为2、“+++”为3、“++++”为4 进行量化值计算，对两种方法的BV 诊断结果进行数值化，以“BV 阴性”为0，“中间型BV”为1，“BV 阳性”为2 进行量化值计算，分别计算同一患者样本采用两种方法检测结果的差异，差异结果为传统方法量化值减去改良方法量化值，差异≠0 即为有差异，差异率为（差值≠0 的样本例数/总检测例数）×100%。两种方法的Nugent 评分差异结果为传统方法的评分减去改良方法的评分，差异≠0 即为有差异，差异率为（差值≠0 的样本例数/总检测例数）×100%［12］。

1.4.2 染色结果判读方法

按照2016年中华医学会妇产科分会发布的阴道微生态评价的临床应用专家共识［12］及2021年细菌性阴道病诊治指南［13］中革兰染色Nugent 评分标准，对菌群密集度、多样性进行标准化评价以及BV的诊断。Nugent 评分以BV 阳性（细菌性阴道病）：≥7 分；中间型BV：4～6 分；BV 阴性（正常）：0～3 分。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据处理；计数资料以n（%）描述，方法间进行配对卡方检验；方法评价采用受试者工作特征（ROC）曲线；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 改良方法建立结果

涂片范围为20 mm×20 mm 时涂片面积大小合适，易于涂布以及镜下观察，最终涂片范围选择20 mm×20 mm 的面积进行定量涂布。阴道分泌物在20 mm×20 mm 范围内均匀涂片，半勺取样量镜下菌量较少稀薄，菌群分步少，易漏诊和错误判读，见图1A；二平勺取样量镜下菌群聚集成团，不易于观察计数，见图1C；一平勺取样量镜下菌群分布均匀，无聚集成团的现象，见图1B；最终选择分泌物取样量一平勺，即0.01 g。改良方案最终确定为：取0.01 g阴道分泌物，在载玻片上20 mm×20 mm 范围内进行均匀涂片，染色后进行后续观察和Nugent 评分。

图1 阴道分泌物不同取样量在20 mm×20 mm 面积下涂片革兰染色结果（革兰染色，×1 000）Figure 1 Gram staining results of smear under different sampling quantities of vaginal secretions at 20 mm×20 mm area（Gram staining，×1 000）

2.2 改良方法与传统方法对菌群密集度差异分析

传统方法与改良方法的菌群密集度结果见表1。两种方法的差异率为56.2%（131/233），改良方法与传统方法密集度比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 传统方法与改良方法菌群密集度结果［n（%）］Table 1 Results of flora density of traditional and improved methods［n（%）］

表2 传统方法与改良方法密集度差异结果［n（%）］Table 2 Results of the difference in density between the traditional method and the improved method［n（%）］

2.3 改良方法与传统方法对菌群多样性分析

传统方法与改良方法的菌群多样性结果，见表3。改良方法与传统方法多样性比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表3 传统方法与改良方法菌群多样性结果［（n%）］Table 3 Results of flora diversity of traditional and improved methods［（n%）］

表4 传统方法与改良方法多样性差异结果［n（%）］Table 4 Diversity differences between traditional methods and improved methods［n（%）］

2.4 Nugent 评分结果差异分析

两种方法的Nugent 评分结果，见表5。改良方法与传统方法Nugent 评分结果比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表6、图2。

表5 传统方法与改良方法Nugent 评分结果［n（%）］Table 5 Nugent score results of traditional and improved methods［n（%）］

表6 传统方法与改良方法Nugent 评分差异结果［n（%）］Table 6 Difference results between traditional method and improved method Nugent score［n（%）］

图2 传统方法与改良方法的Nugent 评分差Figure 2 Nugent score difference between traditional and improved methods

2.3 改良方法与传统对233 例患者细菌性阴道病诊断结果的比较

改良方法与传统方法对BV 的诊断结果比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表7。

表7 传统方法与改良方法Nugent 评分诊断BV 结果［n（%）］Table 7 Traditional and improved methods Nugent score in the diagnosis of BV［n（%）］

2.4 传统方法与改良方法的方法学评价

两种方法的方法学评价结果显示，改良方法（AUC 0.696）优于传统方法（AUC 0.662）。见表8、图3。

图3 传统方法与改良方法的ROC 曲线Figure 3 ROC curves of traditional and improved methods

表8 传统方法与改良方法的方法学评价结果Table 8 Methodological evaluation results of traditional and improved methods

3 讨论

Nugent 评分标准是目前临床诊断中诊断BV的一种重要方法。但Nugent 评分标准缺乏标准化的分析前条件，因为不同的取样工具和程序导致阴道分泌物标本的均匀性和涂片厚度不同，这些差异都将影响其结果的解释［11］。因此，在进行Nugent评分时应有定量化的规范操作，才能实现质量控制。本研究针对Nugent 评分方法的分析前处理进行标准化的制定及操作，用制定的改良方法涂片后在镜下观察菌群密集度、多样性以及进行Nugent评分，并将结果与传统方法涂片后的相关结果进行比较分析，结果都具有统计学差异。并以医生诊断为阴道炎作为标准，比较两种方法诊断结果的准确性，并对两种方法进行方法学评价，得出结果：改良方法对BV 的诊断结果优于传统方法。

本研究的局限性在于改良方法并非绝对定量化，由于采样工具以及涂片工具为自我研制，采样量无法精准定量仍可导致部分误差。在今后的工作中，需要进一步制定商业化的采样工具采样涂片为Nugent 评分方法分析前处理提供可推广的支持，改良方法得以推广应用于诊断BV 的工作中。

综上所述，本研究认为建立分析前操作规范及定量采样，规定面积下涂布，是对Nugent 评分标准在诊断细菌性阴道病的准确性的前提条件，改良方法的建立和使用可提高BV 诊断的准确性。