胎儿染色体非整倍体检测试剂盒质量分析

曲守方 胡泽斌 孙楠 黄传峰 黄杰

染色体非整倍体（Chromosome Aneuploidies）是指相对于人正常的46 条染色体而言，某一条或几条染色体数目增加或减少，与婴幼儿期显著的发病率和死亡率有着密切的关系。其中唐氏综合征（Trisomies 21）、爱德华氏综合征（Trisomies 18）和帕陶氏综合征（Trisomies 13）是临床上最常见的染色体非整倍体疾病［1-3］。产前诊断金标准方法是以创伤性的手术取材方法结合实验室细胞遗传学诊断对胎儿染色体进行核型分析，但有创取样容易导致破水、羊膜腔炎、阴道出血、胎儿刺伤甚至是流产等问题［4］。

随着母体游离胎儿DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）的发现和高通量测序技术的发展成熟，无创胎儿染色体疾病产前检测（Noninvasive Prenatal Testing，NIPT）成为可能［5］。中国食品药品检定研究院于2014年研制高通量测序用外周血胎儿染色体非整倍体（T21、T18 和T13）国家参考品，用于NIPT 试剂盒的上市前的注册检测。2021年国家药品监督管理局批准胎儿染色体非整倍体21 三体、18 三体和13 三体检测试剂盒（高通量测序法）行业标准的发布，用于规范该类产品的标准。本研究使用国家药品监督管理局批准的胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒，对产品技术要求中的阴性参考品符合率、检测限、微缺失微重复参考品符合率和嵌合体参考品符合率等项目进行考察，评价市场上使用的NIPT 试剂盒质量。

1 材料和方法

1.1 材料

高通量测序用外周血胎儿染色体非整倍体（T21、T18 和T13）国家参考品，中国食品药品检定研究院提供。

胎儿染色体非整倍体（T13/T18/T21）检测试剂盒（可逆末端终止测序法）（简称试剂盒A）和Next-Seq CN500 基因测序仪，杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司提供。

胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（可逆末端终止测序法）（简称试剂盒B）和Next-Seq550AR 基因测序仪，安诺优达基因科技（北京）有限公司提供。

胎儿染色体非整倍体（T13、T18、T21）检测试剂盒（可逆末端终止测序法）（简称试剂盒C）和NextSeq550AR 基因测序仪，杭州杰毅麦特医疗器械有限公司提供。

胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）（简称试剂盒D）和BGISEQ-500 基因测序仪，华大生物科技（武汉）有限公司提供。

胎儿染色体非整倍体21 三体、18 三体和13 三体检测试剂盒（半导体测序法）（简称试剂盒E）和DA8600 半导体测序仪，广州市达瑞生物技术股份有限公司提供。

胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（半导体测序法）（简称试剂盒F）和BioelectronSeq 4000测序仪，东莞博奥木华基因科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 血浆游离DNA 提取

采用试剂盒说明书推荐的核酸提取试剂，提取国家参考品的血浆游离DNA。

1.2.2 文库的制备

采用6 家胎儿染色体非整倍体检测试剂盒，对血浆游离DNA 进行文库构建。先将血浆游离DNA 片段末端修复，然后在DNA 片段末端进行接头连接（或者继续进行PCR 扩增），获得文库。使用核酸提取或纯化试剂对文库进行纯化，测定各个文库的浓度，并进行文库的质量检测。

1.2.3 测序

将定量的文库，按照试剂盒规定的比例进行混合。将混合文库加到测序芯片上，使用胎儿染色体非整倍体（T13/T18/T21）检测试剂盒配套的基因测序仪检测。

1.2.4 数据分析

使用试剂盒说明书指定的数据分析软件，进行序列比对及数据统计分析。计算13 号、18 号、21 号染色体的Z 值。根据试剂盒的参考值范围和Z 值大小，进行样本染色体非整倍体的判定，如果样本的染色体Z 值大于等于或者大于试剂盒的相应染色体参考值，判定为该染色体非整倍体。

2 结果

2.1 阴性参考品符合率

对于胎儿游离DNA 10%浓度的国家阴性参考品，包括29 个非21、18 和13 三体的其他染色体非整倍体样本和6 个染色体正常的阴性样本，6 个不同试剂盒结果显示均未检出21 三体、18 三体和13三体。对于其他染色体非整倍体样本，试剂盒C不仅报告试剂盒范围内的21、18 和13 号染色体非整倍体的结果，Z 值均小于3.2；而且报告对性染色体和试剂盒范围外的其他染色体非整倍体的结果，对于25 个其他染色体非整倍体样本检出了21个相应染色体非整倍体阳性，4 个性染色体非整倍体样本检出了2 个阳性。见图1。

图1 试剂盒C 阴性参考品的结果Figure 1 Results of national negative reference by kit C

2.2 检测限

对于72 个胎儿游离DNA 5%浓度的T21、T18和T13 样本（包括高GC PCR 产物和胆红素的干扰样本）和50 个胎儿游离DNA 3.5%浓度的T21、T18 和T13 样本的国家检测限参考品，5%浓度的国家检测限参考品结果显示试剂盒均能正确检出相应染色体三体，准确检出率均是100%；3.5%浓度国家检测限参考品结果显示试剂盒B 检出48个，准确检出率为96%；其余试剂盒均检出50 个，准确检出率是100%。见图2。

图2 国家检测限参考品结果（3.5%）Figure 2 Results of national limit reference（3.5%）

2.3 微缺失微重复参考品符合率

对于胎儿游离DNA 10%浓度的国家微缺失微重复参考品，包括2 个18 号染色体微重复的样本和8 个其他染色体微缺失的样本，18 号染色体微重复的样本结果显示试剂盒均能正确检出18 三体高风险，18 号染色体的Z 值均大于试剂盒的阳性判断值，同时13 三体低风险和21 三体低风险，见图3；而另外8 个其他染色体微缺失的样本结果显示试剂盒均未检出21 三体、18 三体和13 三体。

图3 18 号染色体国家微重复参考品的结果Figure 3 Results of national microduplication reference with chromosome 18

2.4 嵌合体参考品符合率

对于70%和30%嵌合比例的国家嵌合体参考品，试剂盒能够全部正确检出相应染色体三体，相应染色体的Z 值均大于试剂盒的阳性判断值，表明试剂盒能够正确检测出一定嵌合比例的嵌合体样本。见图4。

图4 国家嵌合体参考品的结果Figure 4 Results of national chimera reference

3 讨论

随着出生缺陷防控的需求和优生优育意识的增强，产前筛查和诊断越来越受到重视。与传统的绒毛活检、羊水穿刺或者脐静脉血穿刺等介入性检测相比，NIPT 因其操作便捷、安全性高和准确率高等多方面的优势受到青睐［6-7］。从目前注册检测的试剂盒情况可以看到，胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒的发展呈现多家生产企业、多种高通量测序平台（联合探针锚定聚合测序法、可逆末端终止测序法和半导体测序法）和多种检测方法（如全基因组低深度的高通量测序法、基于SNP 位点的靶向测序技术和基因芯片技术等）的特点。随着行业技术水平的提高，NIPT 针对于胎儿染色体异常的检测也由21 号、18 号和13 号染色体三体进一步扩展至性染色体数目异常、其他的常染色体数目异常以及各种染色体微缺失/微重复等［8-10］。

本研究参考拟实施的推荐性行业标准YY/T 1801-2021 胎儿染色体非整倍体21 三体、18 三体和13 三体检测试剂盒（高通量测序法），使用国家参考品对批准上市的胎儿染色体非整倍体检测试剂盒的质量进行评价［11-12］。研究报道cffDNA 含量低于4%时，NIPT 检测可能失败或出现假阴性结果［13］。现有的商业NIPT 分析需要至少4%的胎儿比例［14-15］。因此国家检测限参考品设置了5%和3.5%胎儿DNA 浓度的不同21 号、18 号和13 号染色体三体样本，用于对试剂盒的检测限性能评价。随着检测技术的提高，国家参考品的检测限要求对胎儿DNA 浓度3.5%的检测限参考品由至少10 个以上的检出提高到必须有25 个以上的检出。3.5%浓度的国家检测限参考品的检测结果表明试剂盒的正确检出率均大于50%。国家嵌合体参考品设置了70%和30%嵌合比例的不同三体样本，用于对试剂盒的嵌合体检测性能的评价。嵌合体参考品的检测结果表明试剂盒均能正确检出30%嵌合比例的三体样本。18 号染色体国家微重复参考品包含了18 号染色体20 Mb 以上重复，要求试剂盒均能检出18 号染色体三体，结果表明试剂盒能够满足要求。本次研究结果显示抽检的产品均无不合格的产品。但是通过对国家参考品的检测结果进行分析时，发现有的产品的软件解读结果存在着超出检测范围的内容，包括对性染色体非整倍体和试剂盒范围外的其他染色体非整倍体的检测结果，并不符合批准的试剂盒对胎儿染色体非整倍体疾病21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征进行产前辅助判断的范围，建议应对产品的分析软件进行相应的修改。本次抽检到的产品在行业标准实施前都已获得注册证，企业都以各自的产品标准或产品技术要求作为其检验的执行标准，但其产品标准或产品技术要求中检测项目与行业标准还是存在一定的差异和问题，企业需要根据行业标准及国家参考品的要求，对自身的技术要求进一步完善，从而保证检测试剂盒的有效性。