当归鸡血藤化裁方发挥类雌激素作用保护去卵巢大鼠骨量流失

余旭东 刘淑刚 高晓璐 陈虎,3*

1.河北中医学院，河北 石家庄 050090 2.河北医科大学第四医院，河北 石家庄 050011 3.河北省中医药科学院，河北 石家庄 050030

骨质疏松症是一种渐进性的全身代谢性骨疾病，临床以骨量低下，骨组织微结构破坏为主要特征[1]。该病好发于绝经后妇女，其主要发病机制为内源性雌激素水平急剧下降，松质骨进行性退变，继而导致骨量严重丢失与骨脆性的增加[2]。遗憾的是，虽然传统的雌激素替代疗法(estrogen replacement therapy，ERT)确实可以降低骨质疏松的风险，但是也极大地增加了心血管、乳腺、子宫等靶器官的负担[3-4]。目前临床上采用钙盐或双膦酸盐、雌激素受体调节剂、甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PHT)等方法治疗骨质疏松症，虽然取得了一定的疗效，但仍存在改善症状不完全或者停药后骨丢失反弹等不良事件[5-7]。在此背景下，一部分患者倾向选择植物来源的膳食补充剂。其中，中草药具有明显优势，中医临床中发现当归鸡血藤化裁方对骨质疏松效果明显，为进一步探索其作用机制，笔者设计了本实验。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

方剂组成与制备：当归20 g，鸡血藤20 g，威灵仙10 g，荆芥10 g，羌活10 g，川芎10 g，秦艽10 g。采用中药颗粒规格，一日一剂，疗程12周，中药颗粒均由江阴天江药业有限公司提供。

实验试剂：碱性磷酸酶(ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAcP-5b)、Ⅰ型胶原C端肽(CTX-1)、17β-雌二醇(17β-E2)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，骨保护素(OPG)购自美国Affinity Biosciences，核因子κB 受体活化因子(RANK)抗体购自武汉博士德工程有限公司，核因子κB 受体活化因子配体(RANKL)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，苏木素染色液，戊巴比妥钠，液氮，10%中性福尔马林溶液，PBS洗液，凝胶配置液，PVDF膜均由河北医科大学第四医院动物实验中心提供。

实验仪器：双能X射线骨密度仪，倒置荧光数码显微镜，生物蛋白质垂直电泳仪，高速低温离心机，全波长扫描式多功能读数仪，各量程单通道移液器。

实验动物：30只SPF级SD大鼠，3月龄，雌性(未交配)，体重(250±10)g，购自河北医科大学动物实验中心。动物生产许可证编号：SCXK(冀)2018-004。本实验通过河北医科大学第四医院伦理委员会审核，批号：IACUC-4th Hos Hebmu-2020015。

1.2 药物剂量

按成年妇女体重60 kg每日用药量90 g计算，每日用药浓度为1.5 g/kg，换算成大鼠等效量剂量1.5 g/kg×6.3=9.45 g/kg。

1.3 实验方法

30只大鼠适应性饲养两周后，随机分为3组：假手术组(Sham组)、去卵巢模型组(OVX组)、去卵巢加药物治疗组(OVX+T组)，每组10只。对空白组大鼠行假手术(只打开腹腔，取部分脂肪组织，不切除卵巢)，对其他2组大鼠均进行双侧卵巢去势手术。依据前期去势大鼠造模成功经验于术后2个月后开始进行正式实验，其中Sham组与OVX组不干预，OVX+T组进行中药灌胃干预，12周后检测骨密度。次日麻醉大鼠行腹主动脉采血后，离心取上层血清置于-80 ℃备用。取股骨漂洗后剔除残余组织，进行形态学与蛋白分析。

1.4 指标检测

1.4.1骨密度检测：双能X线骨密度仪测定大鼠第1～5段腰椎及右股骨的骨密度。

1.4.2血清指标测定：按试剂盒说明书操作，测定血清中17β-E2、CTX-1的含量和ALP、TRAcP-5b的活性。

1.4.3骨组织形态学检测：将股骨置于福尔马林溶液中固定48 h后脱钙处理，放入梯度乙醇脱水、浸蜡、石蜡包埋，之后沿正中矢状面连续切片，厚度约为4 μm，用于苏木精-伊红染色，最后统计大鼠骨小梁面积并进行组织学形态学观察。

1.4.4蛋白表达检测：取大鼠右侧股骨称重，液氮中磨碎，加入RIPA缓冲液裂解提取蛋白。测定蛋白浓度后，使用SDS-PAGE电泳分离蛋白。将电泳后凝胶上的蛋白质转移PVDF膜上，并使用以下一抗：OPG(1∶1 500)，RANKL(1∶1 000)，RANK(1∶1 000)，ERK(1∶1 000)与合适的二抗进行处理，最后将PVDF膜平放至覆有保鲜膜的暗盒中进行曝光处理，扫描胶片并用Tanon Gis软件测定条带灰度值。

1.5 统计学分析

采用SPSS 23.0进行统计学分析。计量数据以均数加减标准差表示，数据进行正态性和方差齐性检验，若符合要求，运用单因素方差分析，组间差异两两比较采用LSD法，若不符合，则用非参数秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。图形绘制由 Graphpad Prism 8.0 软件完成。

2 结果

2.1 当归鸡血藤化裁方对OVX大鼠血清雌激素水平的影响

使用ELISA双抗夹心法对经12周治疗后的3组大鼠进行血清雌激素水平测定。如图1示，与Sham组相比，OVX组大鼠体内雌激素水平显著降低(P<0.05)，与OVX组相比，OVX+T组大鼠雌激素水平升高(P<0.05)。

图1 治疗12周后大鼠血清雌激素水平结果Fig.1 Results of serum estrogen levels in rats after 12 weeks of treatment注：与Sham组比较，**P<0.01；与OVX组比较，#P<0.05。

2.2 当归鸡血藤化裁方对OVX大鼠骨密度的影响

采用双能X线检测大鼠的右侧股骨与腰椎的骨密度。如图2所示，经12周药物干预后，与Sham相比，OVX大鼠的右侧股骨和腰椎的总骨密度均显著降低(P<0.05)。与OVX组相比，OVX+T的治疗显著增加了右侧股骨和腰椎总骨密度(P<0.05)，但低于Sham组的水平。

图2 治疗12周后大鼠股骨(A)及腰椎(B)X线扫描结果Fig.2 X-ray scan results the femur (A) and lumbar (B) in rats after 12 weeks of treatment注：与Sham组比较，**P<0.01；与OVX组比较，##P<0.01。

2.3 当归鸡血藤化裁方对OVX大鼠骨组织形态的影响

三组大鼠股骨HE切片见图3，与Sham组相比，OVX组大鼠骨小梁数量明显降低，部分区域出现骨小梁断裂等骨质疏松的现象；经12周药物干预后，与OVX组相比，OVX+T组骨小梁连接的致密程度、骨小梁数量明显升高。

图3 治疗12周后大鼠股骨组织形态结构(HE，×40)Fig.3 Morphological structure of the femur in rats after 12 weeks of treatment (HE, ×40)注：A：假手术组 B：模型组 C：治疗组

2.4 当归鸡血藤化裁方对OVX大鼠血清骨代谢指标的影响

采用可见光比色法和ELISA双抗夹心法分别测定血清中ALP、CTX-1、TRAcP-5b的含量或活性。如图4所示，OVX组大鼠的血清CTX-1含量及TRAcP-5b、ALP活性均高于Sham组(P<0.05)，但低于OVX+T组水平(P<0.05)。

图4 治疗12周后大鼠血清ALP、CTX-1、TRAcP-5b活性结果Fig.4 Results of serum ALP, CTX-1, TRAcP-5b activity in rats after 12 weeks of treatment注：与Sham组比较，**P<0.01；与OVX组比较，#P<0.05，##P<0.01。

2.5 当归鸡血藤化裁方对OVX大鼠骨组织中RANKL/RANK/OPG与ERK信号通路相关蛋白表达的影响

用蛋白质印迹法测定大鼠股骨中RANKL、RANK、OPG、ERK的表达水平。如图5所示，与Sham组相比，OVX组大鼠OPG、ERK表达水平显著降低，而RANKL、RANK、RANKL/OPG的比率显著升高(P<0.05)。经过药物12周干预后，OPG、ERK表达水平显著升高，而RANKL、RANK、RANKL/OPG的比率均显著降低(P<0.05)。

图5 治疗12周大鼠Western blot蛋白表达结果Fig.5 Western blotting results of protein expression in rats after 12 weeks of treatment注：A：假手术组，B：模型组，C：治疗组。与Sham组比较，**P<0.01；与OVX组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3 讨论

当归鸡血藤汤出自《中医伤科学》，临床主要用于骨伤患者气血虚弱，白细胞或血小板减少症等。已有研究表明当归鸡血藤汤对肩周炎和跟痛症有较好地改善作用[8-9]，但缺乏对骨质疏松疗效的案例报道。针对骨质疏松患者多虚多瘀的病理特点[10]，本研究结合当归鸡血藤汤配伍思路及现代中药药理学研究成果，选用当归、鸡血藤、威灵仙、荆芥、羌活、川芎、秦艽7种中药，组成具有养血活血，祛风除湿止痹功效的当归鸡血藤化裁方，旨在舒筋活络，强健筋骨，改善骨质疏松的症状。

在本实验中，双侧卵巢切除术引起的雌激素缺乏显著降低了骨密度、破坏了骨微组织结构(图2、3)。经过此方12周的治疗，模型大鼠血清雌二醇水平上升，骨密度、骨量及骨微组织均得到明显改善，提示此方在保护模型大鼠骨丢失方面发挥了与雌激素类似的治疗作用(图1)。现代药理学已证明，当归提取物(1%藁本内酯)对去卵巢大鼠和完整大鼠均具有类雌激素作用[11]；鸡血藤主要的活性成分黄酮类化合物与雌激素结构类似[12]；秦艽-威灵仙主要活性成分与ESR1靶点的关系十分密切，而ESR1是雌激素受体主要类型之一，提示秦艽-威灵仙有调节雌激素的作用[13]；川芎成分的中心靶点NCOA1介导了雌激素信号通路[14]。这些药物可能是此方发挥类雌激素作用保护骨量的物质基础。

OPG是一种破骨细胞生成抑制因子，通过与RANKL竞争性的结合抑制骨吸收。RANKL/OPG的比率是评价破骨细胞分化与吸收程度的重要指标[15]。机制研究证明，低水平的雌激素抑制OPG的合成[16-18]，促进RANKL与破骨细胞上的受体RANK结合，激活信号通路并诱导RANKL高表达[19]，继而增强破骨细胞上抗酒石酸酸性磷酸酶活性并大量降解依附在骨细胞上的I型前胶原肽[20-21]，导致血清中TRAcP-5b 及CTX-1的活性水平升高。本实验也证实雌激素的缺乏上调了RANKL/OPG比率及血清TRAcP-5b 、CTX-1的水平，提示雌激素通过RANKL/OPG调控破骨细胞形成与功能。相比之下，当归鸡血藤化裁方能增加OPG的合成并抑制RANKL-RANK的表达(图5)，改善TRAcP-5b 、CTX-1等骨吸收指标(图4)。

本实验发现该方上调OPG表达的同时可以降低ALP的活性，提示该方剂对成骨的有益作用。MAPK是二级信使家族，可响应各种刺激将信号从细胞表面传递到细胞核内，参与调节细胞生长、增殖、凋亡等多种生理功能。其中，ERK/MAPK信号通路在驱动MSCs像成骨细胞谱的转化中发挥着重要的作用。据报道，ERK信号通路可以激活成骨相关转录调节因子，如Runt相关转录因子(RUNX2)和 Osterix (OSX)[22-23]。ERK通路的失活会导致骨量严重地丢失和颅骨的发育不全[24]。一项最新的研究也发现有规律的ERK活性波可以控制成骨细胞的再生[25]。雌激素可以通过膜内的雌激素受体(ER)快速起作用，导致细胞内ERK信号转导通路迅速激活，进而以配体非依赖性方式激活生长因子受体，延长成骨细胞存活时间并促进其分化[26-27]。此外，植物性雌激素与成骨细胞膜上的ER相结合后也可以达到类似的效果[28-29]。与之前的报道一致，当归鸡血藤化裁方可以正向调控模型大鼠股骨中ERK蛋白的表达水平，提示此方可以通过激活ERK/MAPK通路，增强成骨细胞的活性，降低骨量流失的风险。

4 结论

当归鸡血藤化裁方发挥类雌激素的作用抑制骨的高转化率，通过OPG/RANKL/RANK信号通路来促进骨形成并抑制骨吸收，进而来防治由雌激素缺乏引起的骨质疏松症。该方对成骨的积极作用还可能与激活ERK通路有关。这些发现扩展并补充了许多现有信息，有助于中药的发掘并在临床上治疗绝经后骨质疏松症提供一种全新的思路。