补骨脂二氢黄酮甲醚对破骨细胞分化的影响及机制

魏晨旭 朱星宇,4 陆金兰 夏晨洁 李伟东*

1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023 2.教育部中药炮制规范化及标准化工程研究中心，江苏 南京 210023 3.江苏省中药炮制重点实验室，江苏 南京 210023 4.江苏护理职业学院，江苏 淮安 223001

补骨脂为传统补肾健骨类中药，来源于豆科植物补骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果实，具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻的功效，用于肾阳不足、阳痿遗精、遗尿尿频、腰膝冷痛等[1]。现代研究发现，补骨脂及所含活性成分对骨质疏松症有着确切的治疗作用，可以通过调节成骨细胞与破骨细胞的平衡从而缓解骨质疏松症[2-3]。

黄酮类化合物是补骨脂中主要的一类化合物，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗骨质疏松等活性[4]。课题组前期研究了补骨脂中9种黄酮类化合物对成骨细胞的增殖、分化影响，发现在黄酮类化合物中，补骨脂中二氢黄酮类化合物对成骨细胞的增殖与分化作用最强[5]。骨质疏松是由于成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收平衡失调所致[6]，因此，本实验选取补骨脂中对成骨细胞作用最强的二氢黄酮类化合物，补骨脂二氢黄酮、异补骨脂二氢黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚考察其对破骨细胞分化的作用，并从NF-κB信号通路、PI3k/AKT信号通路、MAPK信号通路调节的角度探究其可能的作用机制，从而为补骨脂中二氢黄酮类化合物临床治疗骨质疏松的进一步应用研究提供实验依据，促进其现代药物的开发。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验仪器：恒温培养箱(德国Memmert，INCO108)，电泳仪(美国 Bio-rad Power Supplies Basic)；Trans-Blot Turbo全能型蛋白转印系统(美国 Bio-rad 170-4150)；凝胶成像系统(英国 SYNGENE G:BOXChemiXR5)；多功能酶标仪(美国 MD Spectramac M3)。

1.1.2药物与试剂：小鼠骨髓单核细胞分离液试剂盒(天津灏洋生物制品科技有限责任公司，批号：TBD2013DM)，rmRANKL(R&D公司，Catalog Number 462-TEC，Lot CWA2118041)、rmM-CSF(R&D公司，Catalog Number 416-ML，Lot ME4418061)。抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)。GAPDH (10B8)(中国 江苏凯基生物技术股份有限公司 KGAA002)。p38(中国 北京博奥森生物科技有限公司 bs-0637R)。p-p38(中国 北京博奥森生物科技有限公司 bs-0636R)。p-JNK、JNK、ERK1/2、p-ERK1/2、AKT、p-AKT、NF-κB p65、p-NF-κB p65、p38、p-p38(USA Cell Signaling Technology)。

异补骨脂二氢黄酮(Isobavachin)(纯度≥98%，批号：111220)，补骨脂二氢黄酮(Bavachin)(纯度≥98%，批号：101026)，补骨脂二氢黄酮甲醚(Bavachinin)(纯度≥99%，批号：110502)，以上标准品均购于南京世洲生物科技有限公司。

1.1.3实验动物：ICR小鼠，5周龄(南京中医药大学实验动物中心)，动物许可证号：SCXK(苏)2014-0001，合格证编号：No.201813248。

1.2 实验方法

1.2.1破骨细胞的提取及纯化：破骨细胞的提取与纯化主要参考前期研究的基础[7]，步骤如下：第一天，取5周龄的ICR小鼠在无菌超净台内分离出股骨或胫骨，并剪开骨头两端露出内腔。匀浆冲洗液(产品编号：F2013TBD)冲洗出内腔中的骨髓。反复吹打成细胞悬液，以100 μm细胞筛网过滤至10 mL离心管中。450 g，离心10 min。弃上清，加入样本稀释液(产品编号：2010C1119)重悬细胞，备用。另取一只5 mL玻璃采血管，依次加入分离液1、分离液2和细胞悬液(分离液1与分离液2体积比为3∶1，先后加入分离液 1∶4 mL、分离液2∶1.33 mL。)制成梯度界面。500 g，离心30 min，此时离心需使用水平转子离心机。离心后离心管中由上至下分为6层。吸取含有目的细胞的第二层环状乳白色单核细胞层(第一层白环及上层 50%分离液2)到10 mL离心管中，加入5 mL洗涤液(产品编号：TBDTM-W)，混匀细胞。400 g，离心10 min。弃上清，加入5 mL清洗液(产品编号：2010X1118)重悬所得细胞。250 g，离心10 min。弃上清后加入适量15%的FBS重悬细胞，计数，向细胞悬液中加入巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)使其终浓度为30 ng/mL，将悬液吹打均匀，以密度1.8×105个/cm2种于96孔板中，每孔100 μL。

第二天，吸弃上清，换液，加入含100 ng/mL RANKL+50 ng/mL M-CSF和一定浓度药物的15% FBS 280 μL。培养至第5天结束实验。

1.2.2破骨细胞数量：于提取纯化的第2天，细胞分为4组，分别给予补骨脂二氢黄酮(0.01、10、20、30、40 μmol/L)、异补骨脂二氢黄酮(0.1、5、10、15、30 μmol/L)、补骨脂二氢黄酮甲醚(0.01、1、10、20、30 μmol/L)，对照组不加药物干预。培养第5天的破骨细胞，吸弃剩余上清液，4%多聚甲醛固定30 min，按照抗酒石酸酸性磷酸酶说明对破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色，经电子显微镜拍照计数，拍得的图片用Image J软件进行分析处理，计算破骨细胞数量。

1.2.3抗酒石酸酸性磷酸酶活性：培养至第5天的破骨细胞，吸取上清液50 μL，按照抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒说明于405 nm条件下，用酶标仪测定每孔OD值，计算破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性，并算出各EC50值。

1.2.4作用机制初步研究：(1)细胞分组。实验分为三大组，第一组测p65、p-p65蛋白表达，分为空白组、模型组(M-CSF+RANKL，记为M+R)、给药组(Bavachinin+M-CSF+RANKL)、p65抑制剂组(PDTC 100 μmol/L+M-CSF+RANKL)；第二组测AKT、P-AKT蛋白表达，分为空白组、模型组(M-CSF+RANKL，记为M+R)、给药组(Bavachinin+M-CSF+RANKL)、AKT激动剂组(LM22B-10 20 μmol/L+Bavachinin+M-CSF+RANKL)；第三组测p38、p-p38、JNK、P-JNK、ERK、P-ERK蛋白表达，分为空白组、模型组(M-CSF+RANKL，记为M+R)、给药组(Bavachinin+M-CSF+RANKL)、p38激动剂组[Dehydrocorydaline chloride (DC)200 μmol/L+Bavachinin+M-CSF+RANKL]、JNK激动剂组(Juglanin 10 μmol/L+Bavachinin+M- CSF+RANKL)、ERK激动剂组(Honokiol，20 μmol/L+Bavachinin+M-CSF+RANKL)；其中空白组为不加因子刺激的单核细胞，补骨脂二氢黄酮甲醚给药浓度为20 μmol/L，每组复3孔。给药孵育1 h后，用于后续实验。(2)Western blot。吸弃培养基后，加入预冷的PBS洗两次，振摇数次以尽量去除培养液，按照BCA法测定蛋白浓度。蛋白通过10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后转移至PVDF膜上。将膜与含5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭1.5 h，与一抗p38(1∶200)、p-p38(1∶200)、JNK(1∶1000)、p-JNK(1∶1000)、ERK1/2(1∶1000)、p-ERK1/2(1∶1000)、AKT(1∶1000)、p-AKT(1∶1000)、NF-κB p65 (1∶1000)、p- NF-κB p65 (1∶1000)以及GAPDH (1∶10000)，4 ℃摇床振荡孵育过夜。第二天取出，室温振荡30 min，吸弃一抗，TBST洗10 min×3次后，室温与二抗孵育2 h。最后，ECL化学发光剂盒进行染色，并用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以目标蛋白条带灰度值与GAPDH条带灰度值比值表示目标蛋白表达水平。

1.3 数据统计分析

数据采用均数±标准差表示，用SPSS 20.0统计学软件进行统计处理，统计方法采用单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 破骨细胞分化过程

如图1所示，原代细胞培养分离第1天，细胞呈球形，较小，形态均一；第2天，单核细胞已经贴壁，并且大小不一，可以明显看到部分细胞生长变大，并且部分细胞开始变形，呈不规则形。第3天，细胞开始长出触角，向周围细胞发展，逐渐具有融合的趋势。第4天，破骨细胞开始形成，呈不规则型，向四周聚集，出现大块细胞融合区域。第5天为染色后的破骨细胞，细胞中心可以观察到其细胞器的形状及一些散在的细胞核。

2.2 补骨脂二氢黄酮类化合物对破骨细胞数量的影响

如图2所示，与空白组相比，0.1～30 μmol/L的补骨脂二氢黄酮甲醚可以明显减少破骨细胞的数量(P<0.05)，10～30 μmol/L的异补骨脂二氢黄酮可以明显减少破骨细胞的数量(P<0.01)，20～40 μmol/L的补骨脂二氢黄酮可以明显减少破骨细胞的数量(P<0.01)。以上结果说明，3种二氢黄酮类化合物对破骨细胞的形成均有一定的抑制作用。

2.3 补骨脂二氢黄酮甲醚对破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶活性的影响

如图3所示，与空白组相比，1～30 μmol/L的补骨脂二氢黄酮甲醚可以明显抑制破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性(P<0.05)，20～40 μmol/L的补骨脂二氢黄酮可以明显抑制破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性(P<0.01)，5～30 μmol/L的异补骨脂二氢黄酮可以明显抑制破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性(P<0.01)。以上结果说明，3种二氢黄酮类化合物对破骨细胞的形成均有一定的抑制作用。根据酶活性计算3个化合物对破骨细胞的EC50(μmol/L)，分别如下：补骨脂二氢黄酮甲醚12.39，异补骨脂二氢黄酮15.18，补骨脂二氢黄酮15.89。由EC50值可以看出，补骨脂二氢黄酮甲醚在3个化合物中对破骨细胞的抑制作用最强。

2.4 补骨脂二氢黄酮甲醚对NF-kB信号通路蛋白的影响

如图4所示，与模型组相比，补骨脂二氢黄酮甲醚可以明显降低p-p65/p65的值(P<0.05)，说明补骨脂二氢黄酮甲醚可以抑制p65的磷酸化。与p65磷酸化抑制剂PDTC对比，补骨脂二氢黄酮甲醚组的p-p65/p65值高于PDTC组(P<0.05)，说明补骨脂二氢黄酮甲醚对p65的磷酸化有一定抑制作用，但抑制强度弱于PDTC。

2.5 补骨脂二氢黄酮甲醚对PI3k/AKT信号通路蛋白的影响

如图5所示，与模型组相比，补骨脂二氢黄酮甲醚可以显著抑制AKT的磷酸化(P<0.01)。加入AKT磷酸化激动剂LM22B-10后，AKT磷酸化抑制作用被减弱，与给药组相比磷酸化水平明显升高(P<0.01)。

2.6 补骨脂二氢黄酮甲醚对MAPK信号通路蛋白的影响

如图6所示，与模型组相比，补骨脂二氢黄酮甲醚可以显著抑制ERK的磷酸化(P<0.01)，加入ERK磷酸化激动剂Honoliol后，ERK磷酸化抑制作用被减弱，与给药组相比磷酸化水平明显升高(P<0.05)。与模型组相比，补骨脂二氢黄酮甲醚可以显著抑制p38的磷酸化(P<0.01)，加入p38磷酸化激动剂DC后，p38磷酸化抑制作用被减弱，与给药组相比磷酸化水平明显升高(P<0.01)。与模型组相比，补骨脂二氢黄酮甲醚可以显著抑制JNK的磷酸化(P<0.01)，加入p38磷酸化激动剂Juglanin后，JNK磷酸化抑制作用被减弱，与给药组相比磷酸化水平明显升高(P<0.01)。

3 讨论

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨微结构改变和脆性增加为主要特点的骨骼代谢性疾病，主要发生原因为成骨细胞与破骨细胞的平衡被打破[8]。

其中破骨细胞的过度激活是骨质疏松症发生的重要原因，因此抑制破骨细胞的活性，成为治疗骨质疏松症的主要方法之一[9-10]。

抗酒石酸酸性磷酸酶是公认的破骨细胞标志之一，在骨吸收过程中参与骨基质中矿化底物的降解，其活性强弱标志着破骨细胞的活性，反映骨吸收的强弱[11]。本实验首先通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色，发现补骨脂中3种二氢黄酮类化合物均可以减少破骨细胞的数量。在此基础上，检测各组的酶活性，并计算EC50值，结果发现，补骨脂二氢黄酮甲醚在3个化合物中表现出最强的破骨细胞分化抑制作用。因此，选取补骨脂二氢黄酮甲醚进行进一步的机制初步探讨。

多条通路与骨质疏松的发生发展密切相关，其中OPG/RANK/RANKL途径对骨稳态的调节具有重要作用。在OPG/RANK/RANKL信号通路中，单核细胞上的核因子-κB受体活化因子(RANK)被核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)激活后，引发多条信号传导脉络，可以促进破骨细胞的分化与增殖[3]。其中与破骨细胞分化最主要相关的3条通路如下：NF-κB信号通路、PI3k/AKT信号通路、MAPK信号通路。NF-κB通路在静息状态下，NF-κB的两个亚单位p50/p65与IκB(NF-κB抑制蛋白)结合存在于细胞浆中。当TRAF6识别RANKL后通过NF-κB 可诱导性激酶(NIK)和NF-κB 激酶诱导剂(IKK)活化NF-κB，使其两个亚单位p50/p65与IκB分离并迅速转位进入细胞核来调节破骨细胞分化成熟或凋亡[12]。TRAF6识别RANKL后可激活c-Scr，进而激活PI3k磷酸化AKT，来调节破骨细胞骨架重置、移动并维持其存活[13-14]。MAPK信号通路：包括p38、JNK、ERK 3条支路，p38磷酸化通过活化下游转录因子调节破骨细胞骨吸收关键酶(如TRAP、CATK等)基因的表达促进破骨细胞的分化及骨吸收[15]；JNK磷酸化活化AP-1，诱导c-Fos表达来刺激破骨细胞前体分化成熟[16]；ERK磷酸化可以上调c-Fos的表达促进破骨细胞的分化[17-18]。本实验发现，补骨脂二氢黄酮甲醚可以明显下调p65、AKT、p38、JNK、ERK的磷酸化水平，说明补骨脂二氢黄酮甲醚对破骨细胞抑制作用可能与抑制NF-κB信号通路、PI3k/AKT信号通路、MAPK信号通路的激活有关。

综上所述，补骨脂二氢黄酮甲醚对破骨细胞的分化表现出最强的抑制作用，其作用机制与抑制NF-κB信号通路、PI3k/AKT信号通路、MAPK信号通路的激活相关。本实验结果为补骨脂二氢黄酮甲醚的进一步开发利用及骨质疏松症的临床治疗提供参考。