悬钩子根多糖对2型糖尿病小鼠胰腺线粒体功能的改善作用

代敏敏,常 影,许 娜,王 燕,徐 梦,徐文悦,马佳旺,刘文森,陈正爱

（1.延边大学基础医学院药理学教研室，吉林 延吉 133002；2.吉林医药学院药学院药理学教研室，吉林 吉林 132013；3.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林 长春 130118；4.吉林农业大学生命科学学院生物化学与分子生物学教研室，吉林 长春 130118）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种以高血糖为特征的慢性代谢性疾病，随着经济的发展和人们生活水平的提高，DM患病率逐年上升［1］。根据国际糖尿病联合会2019年的最新报告，到2045年DM患病人数将增加至6.93亿。在全球范围内，大约每11名成人中就有1例DM患者，其中90% 为 2型 糖 尿 病 （diabetes mellitus type 2，T2DM）［2-3］。持续的高血糖状态会严重损害身体各系统，引起各种并发症，最终导致死亡。DM已成为危害全球健康的最重要的慢性非传染性疾病之一［4］。

线粒体是大多数真核细胞正常功能所必需的，在包括骨骼肌、心肌、大脑、胰腺和肝脏等许多组织中的能量代谢和ATP生成中起着关键作用［5］。当线粒体功能出现障碍时，活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生增加，ATP产生不足，进而导致胰腺β细胞功能障碍和胰岛素分泌减少，最终导致血糖升高。目前T2DM的发病机制尚不明确，但是大多数学者认为胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）和β细胞功能障碍是其主要发病机制［6］。研究［7］表明：线粒体功能障碍与IR和β细胞功能障碍的发生发展有密切关联。随着线粒体功能障碍与T2DM关系的深入研究，寻找改善胰腺线粒体功能的药物将有助于T2DM的临床防治。

悬钩子根多糖（Rubus root polysaccharide，RRP）是植物悬钩子的提取物，具有抗氧化、调节免疫、降糖、降脂和抗肿瘤等作用［8-10］。研究［11］显示：在体外实验中，RRP通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK），抑制磷酸烯醇式丙酮酸碳羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase， PEPCK） 和葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate，G6P）的表达水平进而调节脂类和葡萄糖代谢。KE等［12］发现：RRP可通过恢复线粒体功能对棕榈酸诱导的L02细胞毒性发挥保护作用。目前尚无RRP在T2DM小鼠模型中对胰腺线粒体功能影响的相关研究。本研究进一步探讨了RRP的降血糖作用，通过检测小鼠胰腺线粒体功能相关指标，阐明RRP对小鼠胰腺线粒体功能的改善作用，以期为T2DM的预防和治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6周龄雄性C57BL/6J小鼠，体质量（24±2）g，购自辽宁长生生物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（辽）2015-0001。小鼠在通风良好、12 h昼夜交替、室温（24±2）℃和相对湿度（50±10）%的条件下标准化分笼饲养，自由摄食饮水。

1.2 主要试剂和仪器 RRP从悬钩子根部提取，纯度≥85%，提取方法见参考文献［9］和参考文献 ［13］。链脲佐菌素 （streptozocin， STZ）（美国Sigma公司），二甲双胍（北京京风制药有限公司），MIR05-kit（北京华威中仪科技有限公司），葡萄糖检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），小鼠胰岛素酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 试 剂 盒 （美 国EMD Millipore公司），小鼠胰高血糖素（glucagon，GC）ELISA试剂盒（上海酶联生物技术有限公司），小鼠C肽ELISA试剂盒（武汉Elabscience生物技术有限公司）。高端多功能酶标仪（奥地利TECAN公司），电子天平（德国多利斯公司），低温高速离心机（日本三洋公司），超低温冰箱（中国海尔公司），OROBOROS O2K高分辨率线粒体功能/细胞能量代谢测量系统（北京华威中仪科技有限公司）。

1.3 T2DM动物模型制备、分组和给药 实验开始前，70只健康SPF小鼠适应性饲养1周。随机选取10只小鼠作为对照组饲喂标准饲料，其余60只小鼠作为模型制备组饲喂高脂饲料。5周后，模型制备组小鼠单次腹腔注射低剂量STZ（130 mg·kg－1）。腹腔注射 STZ 后 1周，禁食不禁水12 h，检测小鼠空腹血糖（fasting blood glucose， FBG） 水平，FBG≥7.8 mmol·L－1的小鼠被认为造模成功，并继续给予高脂饮食。根据血糖结果，从52只造模成功的小鼠中随机选取50只，分为5组：模型组，低、中和高剂量（50、100和200 mg·kg－1） RRP 组 ， 二 甲 双 胍 （200 mg·kg－1）组，每组10只。对照组和模型组小鼠给予等体积生理盐水，每日灌胃1次，连续10周。

1.4 各组小鼠血清FBG水平检测和口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT） 在灌胃后0、30、60、90和120 min采集小鼠血液样品，采用葡萄糖检测试剂盒检测小鼠血清中FBG水平。每4周进行1次OGTT，OGTT测定前禁食不禁水12 h，每组小鼠口服2 mg·kg－1葡萄糖溶液进行OGTT，绘制OGTT的时间-血糖曲线，计算OGTT的时间-血糖曲线下面积（area under curve，AUC）。

1.5 ELISA法检测各组小鼠血清中空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）、C肽和GC水平 各组小鼠禁食不禁水12 h后，通过尾静脉收集血液样品。采用ELISA法检测各组小鼠血清中FINS、C肽和GC水平。计算稳态模型胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR），HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

1.6 计算各组小鼠胰腺指数 实验结束后，记录小鼠体质量，断髓处死后收集小鼠新鲜胰腺组织，并计算胰腺指数，胰腺指数=胰腺质量（g）/体质量（g）×100%。

1.7 检测各组小鼠胰腺组织线粒体功能 各组小鼠胰腺组织解冻后，用预冷的PBS缓冲液清洗3次，根据胰腺组织质量（g）∶PBS缓冲液体积（mL）=1∶9加入预冷的PBS缓冲液，充分研磨后使用OROBOROS O2K高分辨率线粒体功能/细胞能量代谢测量系统检测各组小鼠胰腺线粒体功能。氧气校准后，在玻璃腔中加入2 mL MIR05-kit，然后分别加入各种底物、解偶联剂和抑制剂等物质。通过O2K软件对数据进行分析，实时综合检测磷氧比（ADP∶O ratio，ADP/O）、呼吸控制率（respiratory control rate，RCR）和基础呼吸耗氧量。

1.8 HE染色观察各组小鼠胰腺组织病理形态表现 胰腺组织样本固定在4%多聚甲醛中，经过一系列酒精脱水，二甲苯清除，石蜡包埋。常规制备4 μm厚度的胰腺组织切片进行HE染色，光镜下观察小鼠胰腺组织病理形态表现。

1.9 统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行统计学分析。各组小鼠体质量、饮水量和摄食量，血清中FBG、FINS、C肽和GC水平，OGTT的AUC、HOMA-IR和胰腺指数，线粒体功能相关指标ADP/O、RCR和基础呼吸耗氧量符合正态分布，以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠一般状态 与对照组比较，模型组小鼠精神萎靡，毛色粗糙，自主活动减少；与模型组比较，各剂量RRP组和二甲双胍组小鼠精神状态、毛色和自主活动在一定程度上有所改善。与对照组比较，模型组小鼠体质量明显降低（P＜0.05），饮水量和摄食量明显增加（P＜0.05）。与模型组比较，中和高剂量RRP组及二甲双胍组小鼠体质量明显增加（P＜0.05），饮水量和摄食量明显减少（P＜0.05）；低剂量RRP组小鼠体质量有升高趋势，饮水量和摄食量有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组小鼠一般状态Tab.1 General state of mice in various groups(n=3，±s）

表1 各组小鼠一般状态Tab.1 General state of mice in various groups(n=3，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Body mass(m/g)30.57±0.47 25.50±1.11*Drinking water(V/mL)5.43±0.75 18.27±0.95*Food intake(m/g)4.67±0.59 7.60±0.40*7.33±0.67 6.20±0.75△5.00±0.89△4.27±0.96△Control Model RRP Low dose Medium dose High dose Metformin 26.50±0.85 27.47±0.74△29.07±1.23△30.77±1.12△16.57±0.99 12.33±1.86△9.37±1.30△6.27±0.61△

2.2 各组小鼠血清中FBG水平、OGTT的AUC和HOMA-IR 与对照组比较，模型组小鼠血清中FBG水平、OGTT的AUC和HOMA-IR明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，中和高剂量RRP组及二甲双胍组小鼠血清中FBG水平、OGTT的AUC和HOMA-IR明显降低（P＜0.05）；低剂量RRP组小鼠血清中FBG水平和HOMA-IR明显降低（P＜0.05），OGTT的AUC有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 各组小鼠血清中FBG水平（A）、OGTT曲线（B）、OGTT的AUC（C）和HOMA-IR（D）Fig.1 Serum FBG levels（A）,OGTT curves（B）,AUC of OGTT（C）,and HOMA-IR（D）of mice in various groups

2.3 各组小鼠血清中FINS、C肽和GC水平 与对照组比较，模型组小鼠血清中FINS和C肽水平明显降低 （P＜0.05），GC水 平明显升高 （P＜0.05）。与模型组比较，中和高剂量RRP组及二甲双胍组小鼠血清中FINS和C肽水平明显升高（P＜0.05），GC水平明显降低（P＜0.05）；低剂量RRP组小鼠血清中FINS和C肽水平有升高趋势，GC水平有下降趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠血清中FINS、C肽和GC水平Tab.2 Levels of FINS,C-peptide,and GC in serum of mice in various groups (n=3，±s）

表2 各组小鼠血清中FINS、C肽和GC水平Tab.2 Levels of FINS,C-peptide,and GC in serum of mice in various groups (n=3，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Control Model RRP Low dose Medium dose High dose Metformin FINS[λB/(mIU·L－1)]17.09±1.10 11.04±0.93*C-peptide[ρB/(mg·L－1)]2.93±0.38 0.45±0.16*GC[λB/(mU·L－1)]29.35±0.32 60.47±3.47*54.07±5.03 49.23±5.82△33.97±6.69△38.45±1.79△11.35±0.14 13.01±0.47△15.44±0.98△15.40±0.38△0.73±0.21 1.27±0.15△1.90±0.20△1.93±0.38△

2.4 各组小鼠胰腺指数 与对照组比较，模型组小鼠胰腺指数明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，各剂量RRP组和二甲双胍组小鼠胰腺指数明显升高（P＜0.05）。见图2。

图2 各组小鼠胰腺指数Fig.2 Pancreatic indexes of mice in various groups

2.5 各组小鼠胰腺线粒体功能 与对照组比较，模型组小鼠胰腺线粒体ADP/O、RCR和基础呼吸耗氧量均明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，中和高剂量RRP组及二甲双胍组小鼠胰腺线粒体ADP/O、RCR和基础呼吸耗氧量均明显升高（P＜0.05）；低剂量RRP组小鼠胰腺线粒体ADP/O和RCR有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）， 基 础 呼 吸 耗 氧 量 明 显 升 高 （P＜0.05）。见表 3。

表3 各组小鼠胰腺线粒体功能Tab.3 Pancreatic mitochondrial function of mice in various groups (n=3，±s）

表3 各组小鼠胰腺线粒体功能Tab.3 Pancreatic mitochondrial function of mice in various groups (n=3，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group.

Group ADP/O RCR Control Model RRP-L Low dose Medium dose High dose Metformin 3.40±0.31 1.43±0.33*2.29±0.32 0.50±0.17*Basal oxygen consumption(pmol/s/x)35.80±2.66 10.37±1.44*15.67±0.71△19.38±1.11△24.70±1.62△27.40±0.36△1.77±0.15 2.13±0.25△2.70±0.20△2.27±0.06△0.71±0.09 1.25±0.09△1.75±0.21△1.66±0.09△

2.6 各组小鼠胰腺组织病理形态表现 与对照组比较，模型组小鼠胰腺组织中胰岛形状不规则，胰岛细胞大小和数量明显减少，胰岛出现炎性细胞浸润和变性坏死。与模型组比较，各剂量RRP组和二甲双胍组小鼠胰腺组织中胰岛形状较完整，胰岛细胞大小和数量不同程度增加，坏死面积减少。见图3。

图3 各组小鼠胰腺组织病理形态表现（HE，×200）Fig.3 Pathomorphology of pancreas tissue of mice in various groups(HE,×200)

3 讨 论

T2DM小鼠模型的建立多采用化学药物诱导的方法，目前常用的诱导剂有STZ和四氧嘧啶［14］。STZ是一种广谱抗生素，能够在短时间内特异性的损害β细胞，从而导致机体内胰岛素分泌不足［15］。由于STZ造模稳定性好，对机体损伤较小，并且高脂饮食联合低剂量STZ的方法能够很好地模拟人类DM患者新陈代谢的自然进展和变化，是一种常用的建立实验性T2DM动物模型的途径［16-17］。因此本研究采用高脂饲料联合腹腔注射低剂量STZ的方法建立T2DM小鼠模型，模型制备组小鼠连续4周给予高脂饮食，随后注射STZ，1周后检测小鼠的FBG，结果显示：模型制备组小鼠FBG水平 ≥7.8 mmol·L－1，OGTT 的 AUC 和 HOMA-IR升高，胰腺组织结构被破坏，表明T2DM小鼠模型制备成功。本研究结果显示：RRP可明显降低T2DM小鼠的FBG，改善糖耐量和胰腺组织结构，表明RRP具有明显的降血糖作用。

胰腺是人体的重要器官，主要分泌胰岛素和胰高血糖素来控制机体的葡萄糖代谢。当胰腺功能发生紊乱时，会导致胰岛素分泌异常或胰岛素抵抗［18］。为研究RRP对小鼠胰腺的影响，本研究检测了各组小鼠血清中FINS、C肽和GC水平及胰腺指数。C肽在等摩尔的基础上与胰岛素共分泌，衡量β细胞功能的金标准是评估血浆中的C肽水平［19］。胰腺指数在一定程度上可以反映胰岛结构是否受损［20-21］。本研究结果显示：RRP治疗后，T2DM小鼠血清中FINS、C肽水平和胰腺指数均升高，GC水平降低，表明RRP可以通过改善T2DM小鼠的胰腺功能，促进胰岛素分泌，进而调节T2DM小鼠的血糖。此外，本研究中小鼠胰腺组织病理学结果证实：RRP可以改善T2DM小鼠胰腺组织的形态表现。

线粒体最主要的功能就是通过氧化磷酸化产生能量，维持机体正常生理活动［22-23］，其功能障碍会导致细胞功能受损。线粒体呼吸是线粒体系统能量代谢过程中最重要的步骤，ADP/O和RCR能够衡量线粒体功能结构完整程度，反映线粒体氧化磷酸化的偶联功能，体现线粒体的能量转化效能［24-25］。本实验采用ADP/O、RCR和基础呼吸耗氧量反映线粒体的呼吸功能和ATP的合成能力，结果显示：与对照组比较，模型组小鼠胰腺线粒体ADP/O、RCR和基础呼吸耗氧量均明显降低，且RRP干预10周后可以逆转上述变化，表明RRP可以改善T2DM小鼠的胰腺线粒体功能。

本研究探讨了RRP对T2DM小鼠胰腺线粒体功能的改善作用，其改善作用是RRP本身的作用还是其代谢产物的影响，尚需进一步研究。本研究结果显示：RRP能够使T2DM小鼠血清中FBG和GC水平及HOMA-IR明显降低，血清FINS和C肽水平、ADP/O、RCR、基础呼吸耗氧量和胰腺指数明显升高，同时T2DM小鼠的糖耐量和胰腺组织结构损伤明显改善。综上所述，RRP能够改善T2DM小鼠胰腺线粒体功能，促进胰岛素的分泌，进而调节血糖。