CD47敲除对小鼠颅脑创伤后血管生成的影响及其分子机制

陈可欣,屈东昊,刘晓龙,陈 勃,张舒岩

（1.吉林大学第一医院转化医学研究院实验平台，吉林 长春 130021；2.吉林大学第一医院神经创伤外科，吉林 长春 130021）

颅脑创伤（traumatic brain injury，TBI）是国内外严重的公共卫生问题之一，不仅伴随着诸多复杂的创伤后遗症，还会导致较高的致残率和致死率［1-2］。目前，针对TBI潜在干预靶点的研究已经十分广泛，但真正转化为临床应用的可行性治疗靶点很少。近年来已有相关研究［3-4］开始探索血管功能改善在TBI后修复神经功能障碍中的作用。血管新生可以恢复缺血区域的血供，挽救损伤的神经元，已成为TBI治疗的一个新的研究方向［5］。整合素 相 关 蛋 白 （integrin-associated protein，IAP）CD47，是一种细胞表面受体，也称为“don’t eat me”信号，广泛表达于各种细胞［6-7］。既往研究［8］表明：CD47在动脉粥样硬化斑块、中风和血管老化的过程中发挥关键作用。CD47可被血小板反应蛋白1（thrombospondin-1，TSP-1）激活，导致一氧化氮（nitric oxide，NO）生成从而抑制信号传导。CD47/TSP-1复合物通过促进活性氧的产生而引起血管疾病［8-9］。到目前为止，关于CD47在TBI中作用的研究还十分有限。因此，本文作者利用CD47敲除小鼠研究TBI后小鼠脑组织血管生成情况和CD47敲除对小鼠TBI后血管生成的影响，以期为TBI的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器 C57BL/6小鼠，动物生产许可证号：SCXK（吉）-2019-0001；CD47敲除同时内源性表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein， GFP） 的 C57BL/6 小 鼠（CD47KO-GFP小鼠），动物使用许可证号：SYXK（吉）-2022-0001；均为8周龄，体质量20～25 g，由吉林大学第一医院动物中心繁育获得。小鼠饲养在吉林大学第一医院动物中心，环境保持恒定温度（21℃±3℃）和恒定湿度（55%±5%），并给予12 h的光照/黑暗循环。所有涉及动物的程序均经吉林大学实验动物委员会批准。血小板-内皮细胞黏附分子1（phtelet endothelial cell adhesion molecule-l， PECAM-1） 即 CD31抗体购自美国Abcam公司（货号：ab7388），血管内皮细胞生长因子受体1（vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1）抗体购自美国CST公司 （货 号：2479）， 核 因 子 κB（nuclear factorkappa B，NF-κB）抗体购自美国Affinity公司（货号：AF5006），Alexa Fluor 594二抗和DAPI均购自美国Absin公司（货号：abs20021和abs933），M131培养基购自美国Gibco-lnvitrogen公司。液压颅脑打击仪（PCI 3000）购自美国弗吉尼亚大学医学工程部，荧光Nikon Ti-E倒置显微镜购自日本Nikon公司，BX53光学显微镜和Ⅸ73荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司。

1.2 实验动物分组 小鼠随机分为假手术组和TBI组，每组20只，造模完成后行脑含水量检测、血脑屏障通透性检测、HE染色和免疫荧光实验；另各取10只野生型C57BL16小鼠（野生型组）和CD47KO-GFP小鼠 （CD47KO-GFP组），TBI造模后提取脑微血管内皮细胞行免疫荧光检测。

1.3 可控性液压颅脑打击仪制备小鼠TBI模型 采用液压颅脑打击仪建立小鼠TBI模型。小鼠采用4%异氟烷诱导麻醉和1.5%异氟烷维持麻醉后，剃除头部毛发，俯卧位固定于脑立体定向仪上，用碘伏消毒后沿中线切开头皮，分离骨膜，暴露颅骨。以前囟后2.0 mm、中线右侧旁开2.0 mm为中心，钻直径3.0 mm圆形骨窗（保持硬脑膜的完整性）。骨窗建立后，将液压冲击器的冲击管口小心放置在骨窗内，周围用牙托粉固定冲击管并密闭管口周边缝隙。调整摆锤与垂直方向的角度，造成颅脑损伤。注意维持小鼠体温，待生命体征平稳后缝合头皮。

1.4 小鼠脑组织含水量检测 采用干/湿比重法检测小鼠脑组织含水量。模型建立后24 h，每组选取5只小鼠处死。取脑组织，弃去小脑和双侧嗅球。沿大脑中线将大脑分成正常侧和打击侧。用滤纸吸干表面水分，先称量大脑半球湿质量后，置于110℃恒温箱中烘烤24 h至恒质量，称量干质量。脑含水量=（脑湿质量－脑干质量）/脑湿质量×100%。

1.5 伊文思蓝（Evans blue，EB）注射法检测小鼠血脑屏障通透性 术后24 h，每组取5只小鼠，经4%水合氯醛麻醉，股静脉注射2%EB生理盐水液3 mL·kg－1。2 h后向左心室灌注生理盐水至右心房流出无色液体，断头取脑，剥离干净软脑膜和血凝块，左右半球分开，滤纸吸干右半球水分，取病灶区脑组织，称湿质量后置于盛有3 mL甲酰胺的试管中，加上橡皮塞置37℃恒温水浴箱中。48 h后吸取上清液，紫外分光光度计（波长=632 nm）进行比色，测得吸光度（A）值。根据标准曲线，计算EB水平（μg·g－1）。以小鼠脑组织中EB水平代表血脑屏障通透性。

1.6 HE染色观察小鼠脑组织病理形态表现 在TBI模型建立后24 h，每组选取5只小鼠，用4%水合氯醛腹腔注射麻醉成功后打开胸腔，先用生理盐水进行心脏灌注，观察肝脏逐渐变为白色为止，再用4%多聚甲醛进行心脏灌注，待四肢抽动后断头取脑，将脑组织放在4%甲醛中固定24 h，石蜡包埋后制成切片，进行常规HE染色，光学显微镜下观察小鼠脑组织病理形态表现。

1.7 小鼠脑微血管内皮细胞培养 根据参考文献［10］中的方法分离CD47KO-GFP组小鼠和野生型组小鼠的脑微血管内皮细胞，并立即培养。使用含5%MVGS的M131培养基，在37℃、5%CO2的恒温细胞培养箱内进行培养，每4 d以1∶3传代培养。将CD47KO-GFP组小鼠和野生型组小鼠脑微血管内皮细胞共培养，通过光学显微镜和荧光显微镜观察并记录细胞生长状态、再生情况和血管生成情况。

1.8 免疫荧光染色法检测小鼠脑组织中VEGFR1和CD31蛋白表达水平及NF-κB在脑微血管内皮细胞中的活化情况 小鼠脑组织用4%多聚甲醛固定并用0.3%Triton X-100打孔后，用5%正常BSA封闭。用CD31和VEGFR1抗体在4℃下过夜后，与偶联IgG的Alexa Fluor488二抗和偶联IgG的Alexa Fluor 594二抗室温90 min。洗涤3次后，用DAPI染色细胞核15 min。通过荧光Nikon Ti-E倒置显微镜观察染色载玻片。根据红色和绿色荧光的表达强度和分布情况，通过Image J软件计算小鼠脑组织中单位面积内VEGFR1和CD31蛋白表达水平。

使用PBS缓冲液清洗小鼠脑微血管内皮细胞3次后，加入4%多聚甲醛室温固定15 min。加入0.3%Triton X-100室温透化10 min，之后加入5%血清进行封闭1 h。然后加入5%免稀释的一抗，4℃过夜。PBS缓冲液清洗3次后加入5%免稀释的二抗，室温放置90 min。PBS缓冲液洗涤3次后，用DAPI染色细胞核15 min。通过荧光Nikon Ti-E倒置显微镜观察染色载玻片，观察NF-κB的活化情况。当NF-κB分布于细胞浆时处于非活化状态，当NF-κB进入细胞核时处于活化状态。

1.9 小鼠脑微血管内皮细胞血管形成实验 内皮细胞血管形成实验可以检验内皮细胞的能力［11-13］。1∶1混合CD47KO-GFP组小鼠和野生型组小鼠脑微血管内皮细胞共培养，计算单位面积中2组小鼠参与形成管状结构的微血管内皮细胞百分率，评估二者的血管生成能力。

1.10 统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。2组小鼠脑组织含水量、EB水平、VEGFR1和CD31蛋白表达水平及小鼠脑组织中参与血管生成的微血管内皮细胞百分率均符合正态分布，以±s表示，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2组小鼠脑组织含水量和EB水平 与假手术组比较，TBI组小鼠健侧脑组织含水量差异无统计学意义（P＞0.05），TBI组小鼠打击侧脑组织含水量明显增加（P＜0.01）。见表1。假手术组和TBI组小鼠 脑 组 织 中 EB水 平 分 别 为 （2.63±0.53） 和（11.62±1.29） μg·g－1，与假手术组比较，TBI组小鼠脑组织中EB水平明显升高（P＜0.05），小鼠脑组织EB染色明显增强。见图1。

图1 2组小鼠脑组织EB染色结果(Bar=0.5 cm)Fig.1 Results of EB staining of brain tissue of mice in two groups(Bar=0.5 cm)

表1 2组小鼠脑组织含水量Water contents in brain tissue of mice in two groups（n=5，±s,η/%）

表1 2组小鼠脑组织含水量Water contents in brain tissue of mice in two groups（n=5，±s,η/%）

*P＜0.01 vs sham operation group.

Group Sham operation TBI Injured side 75.02±0.67 80.40±0.68*Water content Normal side 74.99±0.43 75.14±0.41

2.2 2组小鼠脑组织病理形态表现 假手术组小鼠脑组织结构正常；TBI组小鼠脑组织原有的脑组织结构无法清晰辨认，细胞核浓染色，出现细胞核周围环形低染色甚至空白染色区，出血点明显。见图2。

图2 2组小鼠脑组织病理形态表现（Bar=200 μm）Fig.2 Pathomorphology of brain tissue of mice in two groups（Bar=200 μ m）

2.3 2组小鼠脑组织中VEGFR1和CD31蛋白表达水平 免疫荧光染色检测， TBI后24 h，假手术组小鼠脑组织中少见VEGFR1和CD31阳性的脑血管内皮细胞；与假手术组比较，TBI组小鼠脑组织中VEGFR1和CD31蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）。见图3和4。

图3 免疫荧光染色法检测2组小鼠脑组织中VEGFR1和CD31的表达情况（Bar=200 μm）Fig.3 Expressions of VEGFR1 and CD31 in brain tissue of mice in two groups detected by immunofluorescence staining assay（Bar=200 μm）

图4 2组小鼠脑组织中VEGFR1(A)和CD31(B)蛋白表达水平Fig.4 Expression levels of VEGFR1(A)and CD31(B)proteins in brain tissue of mice in two groups

2.4 2组小鼠脑组织中参与血管生成的微血管内皮细胞百分率 与野生组比较，CD47KO-GFP组小鼠脑组织中参与血管生成的微血管内皮细胞百分率明显增加（P＜0.05）。见图5和6。图5A为2组小鼠脑血管内皮细胞混合培养24 h后的明场图像，图5B为在荧光显微镜下对图5A中GFP阳性脑血管内皮细胞进行观测，图5C为A与B叠加后的图片（Merge）。

图5 荧光显微镜下观察2组小鼠脑微血管内皮细胞共培养情况（Bar=200 μm）Fig.5 Co-culture of cerebral microvascular endothelial cells in two groups observed under fluorescence microscope（Bar=200 μm）

图6 2组小鼠脑组织中参与血管生成的微血管内皮细胞百分率Fig.6 Percentages of microvascular endothelial cells participating in angiogenesis in brain tissue of mice in two groups

2.5 2组小鼠脑组织微血管内皮细胞中NF-κB活化情况 免疫荧光染色检测，野生型组小鼠源的脑微血管内皮细胞中NF-κB既存在于细胞浆中又存在于细胞核内，即NF-κB处于活化状态；CD47 KO-GFP组小鼠源的脑微血管内皮细胞中NF-κB大部分存在于细胞浆中，几乎不存在于细胞核中，即NF-κB处于非活化状态。见图7。

图7 免疫荧光染色法检测2组小鼠脑微血管内皮细胞中NF-κB的活化状态（Bar=200 μm）Fig.7 Activation of NF-κB in brain microvascular endothelial cells of mice in two groups detected by immunofluorescence staining assay（Bar=200 μm）

3 讨 论

TBI是公共卫生问题的巨大挑战。但在近几十年中针对TBI的研究能够成功转化到临床的极少［14］。脑外伤伴随的血管剪切性损伤破坏了血脑屏障的完整性，导致血管源性的脑组织水肿，引起颅内压升高［15］。血管网络是维持脑组织代谢和神经功能的基础［16］，脑血管功能障碍普遍存在于所有TBI相关损伤中［17］，TBI后损伤的脉管系统会试图进行修复。本研究结果显示：TBI后小鼠VEGFR1和CD31双阳性细胞数量明显增多并且分布和表达情况一致。VEGFR1是血管生成的关键调节剂，在控制伤口愈合和维持血管通透性等过程发挥重要作用。CD31是内皮标志物之一，增强的CD31表达可诱导血管生成。TBI发生后，二者表达同时上调不仅可以促进损伤的血脑屏障恢复，还可以促进侧支循环的重建，有利于神经元存活和神经功能恢复。

CD47与TSP-1结合可抑制NO和VEGFR1的促血管生成作用，并引起由缺氧、缺血和再灌注引起的组织损伤。目前已有多项研究［18-21］通过CD47KO小鼠分析CD47在损伤组织中的作用：CD47敲除可减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤［19］，提高暴露于辐射下小鼠的存活率，还可减轻多壁碳纳米管暴露后导致的肺部微血管功能障碍。本研究结果显示：CD47敲除可使小鼠脑微血管内皮细胞的成管能力增强。CD47与TSP-1结合抑制VEGFR2活化及其下游基因的表达，但不抑制VEGF与VEGFR2结合，最终导致新血管形成受到抑制［8］。此外，TSP-1/CD47还可以通过抑制内皮细胞、血管平滑肌、血小板和内皮细胞中的关键血管生成标志物进而抑制血管生成［22］。还有研究［23］显示：TSP-1/CD47 可以影响 NF-κB/激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）的激活，造成炎症反应的改变。本研究结果证实了CD47KO小鼠NF-κB的表达和分泌受抑制。NF-κB是胞内重要的炎症因子启动基因。当NF-κB信号受到抑制时，中枢神经系统损伤后的神经炎症反应也受到抑制［24-26］。已有研究［27］证实：在肺癌细胞中肿瘤坏死 因 子 α（tumor necrosis factor-α， TNF-α） /NF-κB信号通路的表达受CD47表达的调控。因此推测TBI后小鼠脑组织中CD47KO抑制损伤脑组织炎症因子启动基因（NF-κB）活性，进而抑制神经炎症反应，从另一方面改善TBI的愈后。

综上所述，小鼠TBI后血脑屏障通透性明显增加，损伤脑组织的血管生成增强，CD47敲除可促进血管生成，抑制NF-κB的活性，减轻神经炎症反应。因此，通过对CD47的干预以促进脑微血管上皮细胞的新生，CD47敲除有可能成为治疗早期TBI并逆转TBI患者神经功能损伤的有效方法。