眼库获取的角膜内皮细胞密度变化规律及影响因素研究△

龙俊君 李兰 曹倩 李云川 李勇 田二苗

(昆明市第一人民医院眼科 昆明 650000)

当下角膜供体严重缺乏，在我国约400万等待角膜移植的患者，而每年仅1万余人进行手术[1]。在角膜供体如此缺乏的情况下，规范眼库管理为临床提供更多优质的角膜植片尤为重要。2016年，美国从62家眼库收集了69 049名捐赠者捐赠的136 318枚眼角膜，却有近26%的捐赠角膜通过评估后被认为不适合移植[2]。

供体角膜评估主要包括角膜内皮细胞活性、微生物污染控制以及免疫原性[3]，角膜内皮细胞活性是评价供体质量的重要因素。在我们植片获取和保存过程中易受环境等因素的制约，因此不同国家和地区的获取标准不尽相同[4-6]。关于供体角膜内皮细胞影响因素的研究目前仍没有定论，而角膜内皮细胞密度随死亡-获取时间、年龄等多种相关因素的变化规律有待进一步阐明。本文对116枚供体角膜进行内皮细胞密度监测，探究在获取过程中影响角膜内皮细胞密度的因素，以期为优化角膜取材及保存的流程提供参考。

1 资料与方法

1.1 资料 收集2019年1月~2021年1月于本院获取的供体角膜植片132枚，符合标准116枚(87.8%)，16枚排除(12.1%)。其中8枚(6.0%)因角膜溃疡排除，6枚(4.5%)因患有传染性疾病排除，1枚(0.7%)因既往内眼手术史排除，1枚(0.7%)因既往青光眼病史排除，余116枚角膜供体纳入研究。

1.2 试剂与仪器 试剂：Eusol-C中期保存液、Ⅲ型安尔碘溶液。器材：内皮显微镜(EB-3000 XYZ型，HAI公司，美国)、角膜剪、开睑器、持针器、手术刀。分析软件：内皮分析软件(CASEB 2.20，HAI公司，美国)。

1.3 研究方法

1.3.1 获取角膜组织(原位角膜切除) ①消毒铺巾，Ⅲ型安尔碘溶液冲洗结膜囊；②角膜剪沿角巩膜缘剪开结膜囊，分离结膜下组织，手术刀于角巩膜缘后3 mm处切开巩膜，直达色素膜，角膜剪360°剪开巩膜，取下角膜植片，保存于4 ℃，Eusol-C中期保存液中，内皮面朝上；③置塑料透明角膜片于眼表创面，闭合睑缘，恢复仪容。

1.3.2 检测方法 ①参照《眼库管理中华人民共和国卫生行业标准》[3]，制订角膜组织报告表。记录供体编号、性别、年龄、死亡原因、死亡-获取时间，取材后立即进行保存并由同一名医师进行内皮细胞密度的检测。②裂隙灯显微镜检查：角膜上皮层均完整；基质层无水肿、瘢痕；后弹力层无褶皱。③内皮细胞密度检测：将装有供体角膜植片的保存液瓶装入内皮显微镜的固定槽中，调节镜头的位置找到中央角膜，调整粗准焦螺旋找到角膜内皮层，进一步调整细准焦螺旋使得内皮细胞成像清晰，拍摄内皮细胞图，选择其中的50~100个细胞，运用CASEB 2.20 内皮分析软件对所拍摄的图片进行内皮密度分析，对同一角膜植片重复测量3次取平均值，记录数据。取材及检测均由同一医师进行。

1.4 统计学处理 运用SPSS 23.0软件将所收集数据整理后进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示，计数资料采用频数或率表示。满足正态分布与方差齐性的资料采用单因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)，不满足的资料则采用秩和检验。运用多元线性回归分析研究死亡-获取时间与角膜内皮细胞密度的变化规律。以P＜0.05判定为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 供体年龄与角膜内皮细胞相关性 116枚角膜供体中，年龄为(35.46±12.55)岁，按年龄将所测量的供体植片进行分组(表1)。其中＜30岁组，48例，平均角膜内皮细胞密度为(3 151.770±347.288)个/mm2；＞30岁组，68例，平均角膜内皮细胞密度为(2 846.338±338.867)个/mm2。不同年龄的供体角膜内皮细胞密度差异有统计学意义(F=22.395，P＜0.001)。

2.2 供体死亡原因与角膜内皮细胞相关性 本研究中供体因外伤死亡的有86例，余30例死于心脑血管意外(表1)。2组不同死亡原因的供体角膜内皮细胞密度差异无统计学意义(F=1.444，P=0.232)。

2.3 供体死亡-获取时间与角膜内皮细胞相关性

2.3.1 供体死亡-获取时间与角膜内皮细胞密度 将116例角膜供体按死亡-获取时间分组(图1)，0~2 h组，40例，平均角膜内皮细胞密度为(3 179.975±335.365)个/ mm2；2~4 h组，42例，平均角膜内皮细胞密度为(2 962.595±355.271)个/ mm2；4~6 h组，34例，平均角膜内皮细胞密度为(2 741.411±295.646)个/mm2。随死亡-获取时间延长所拍摄图片角膜内皮细胞清晰程度下降，图C中因角膜水肿无法拍摄出清晰的图像，而图D中出现了无内皮细胞区。116枚供体角膜内皮细胞密度均＞2 000个/mm2。

图1 不同死亡-获取时间供体植片角膜内皮细胞拍摄图片 A.死亡-获取时间为0.5 h，角膜内皮细胞密度为3 701 个/mm2；B.死亡-获取时间为2.25 h，角膜内皮细胞密度为3 190 个/mm2；C.死亡-获取时间5.2 h，角膜内皮细胞密度为2 806 个/mm2，角膜植片部分出现水肿，所测角膜内皮细胞图像清晰度下降；D.死亡-获取时间为5.5 h，角膜内皮细胞密度为2 033 个/mm2，该植片出现了无内皮细胞区。D 所拍摄位置非角膜中央，所测角膜内皮细胞密度为中央角膜内皮细胞密度。

表1显示不同供体死亡-获取时间的角膜内皮细胞密度。不同死亡-获取时间的角膜内皮细胞密度差异有统计学意义(F=16.078，P=0.005)。运用SNK法进行事后检验；对不同死亡-获取时间组间供体角膜内皮细胞密度差值进行两两对比，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 角膜植片内皮细胞密度

2.3.2 供体死亡-获取时间与角膜内皮细胞六角形细胞占比及变异系数 不同死亡-获取时间的供体角膜内皮细胞六角形细胞占比及变异系数见表2。将3组数据的六角形细胞占比进行ANOVA，结果示不同死亡-获取时间的六角形细胞占比差异有统计学意义(F=4.708，P=0.011)。运用LSD法进行事后检验：对不同死亡-获取时间组间供体角膜内皮细胞六角形细胞占比进行两两对比，0~2 h、2~4 h分别与4~6 h组间差异有统计学意义(P＜0.05)，而0~2 h与2~4 h组间差异无统计学意义(P＞0.05)。将3组数据的变异系数进行ANOVA，结果示不同死亡-获取时间的变异系数差异无统计学意义(F=3.495，P=0.563)。

表2 角膜内皮细胞六角形细胞占比及变异系数

2.4 角膜内皮细胞密度随死亡-获取时间的变化规律 通过之前分析进行因变量的筛选，发现供体年龄、不同死亡-获取时间对角膜内皮细胞密度有统计学意义。采用多元线性回归分析，设角膜内皮细胞密度为因变量Y，自变量分别为年龄X1，死亡-获取时间X2。将所得结果拟合回归方程：Y=3 711.007-11.073X1-124.098X2，拟合度R=0.64，P＜0.05，回归模型有统计学意义。供体角膜内皮细胞密度随供体年龄、死亡-获取时间的变化规律符合线性趋势，且呈负相关。

3 讨论

供体角膜内皮细胞密度及活性是评估植片质量的重要指标，亦是穿透性角膜移植手术成功的保障。角膜内皮细胞是连接角膜与前房的屏障，既能防止房水进入基质层，也具有钠泵功能将角膜基质内的水泵至前房维持角膜透明[7]。然而角膜内皮细胞极易受到损伤，低氧、年龄＞65岁、炎症及内眼手术干扰等多种物理化学因素[8-10]均可造成角膜内皮细胞损伤。角膜内皮细胞损伤或是缺失后依靠相邻的内皮细胞通过伸展、扩大、移行进行修复，不仅会引起数量减少，而且形态大小也会发生变化，造成六角形细胞占比减少。由于角膜移植术后植片曲率变化较大，难以通过非接触式角膜内皮细胞镜进行术后早期的角膜内皮细胞数量及形态进行精确检测，而术后角膜内皮的慢性失代偿仍有待进一步长时间的随访。

本研究结果提示年龄和死亡-获取时间对供体角膜植片内皮细胞密度的影响是相互关联的。供体角膜内皮细胞密度与供体年龄、供体死亡-获取时间呈负相关。目前已有关于供体角膜内皮细胞密度与年龄、保存时间及方法、死亡-获取时间等诸多因素的研究[11]。Armitage等[12]研究表明供体年龄和组织保存时间是影响器官培养法保存的角膜内皮细胞密度的主要因素，较高的供体年龄和较长的保存时间都会降低供体角膜内皮细胞密度。然而Langenbucher等[13]研究则认为储存时间延长可能会增加角膜内皮细胞丢失，但死亡-获取时间与角膜内皮细胞丢失无关。通常认为正常人群角膜内皮细胞密度随年龄增长而下降，60岁后人角膜内皮细胞的数目与形态可发生变化，但对供体年龄与角膜术后成功率的研究认为角膜移植后的成功率和供体年龄并无关系[14]。目前这些研究的结果往往是相互矛盾的。本研究认为影响供体角膜内皮细胞的因素既独立存在也相互影响，对于用作穿透性角膜移植材料的角膜供体，年龄越大则要求死亡-获取时间越短。

本研究所收集资料均用于临床穿透性角膜移植手术，暂无死亡-获取时间＞6 h的病例。研究发现，虽然在6 h内所获取的角膜植片的内皮细胞密度均＞2 000个/mm2，但是随死亡-获取时间延长，所测角膜内皮细胞密度呈线性下降趋势。因此在进行增视性角膜移植手术，例如圆锥角膜患者的穿透性角膜移植手术时，不建议使用死亡-获取时间＞6 h的供体植片。死亡-获取时间对角膜内皮细胞的影响机制是由于死后生命活动停止，使得机体处于缺氧状态，房水停止生成，而原本在前房里的房水氧含量随死亡时间延长而下降，最终导致角膜内皮细胞丢失[15]。通常认为死亡-获取时间＞12 h，角膜内皮细胞将被灭活，因此国内外眼库多要求供体死亡时间＜6 h[16]。在我国由于供体的稀缺，谢立信等[17]曾将7枚死亡-获取时间＞12 h的供体植片进行移植，监测到受体术后半年角膜内皮细胞数平均为1 230个/mm2，即供体死亡-获取时间＞12 h也可用于穿孔感染等治疗性角膜移植。国外也报道了类似研究，Parekh等[18]对死亡-获取时间为0.3~25.6 h的733个角膜供体进行研究，发现在保存过程中，死亡-获取时间对内皮细胞没有影响。然而，在对接受植片死亡-获取时间＞10 h的患者进行随访的过程中发现，较长的死亡-获取时间会对角膜移植患者移植后的内皮细胞丢失有影响，因此，排除手术创伤外，死亡-获取时间也是影响内皮细胞密度的潜在因素之一。目前各国对死亡-供体保存时间尚未作严格要求，仅均强调应尽快摘取和保存供体眼组织。

本研究所监测的角膜内皮细胞密度与死亡-获取时间和供体年龄相关性的回归模型，拟合度仅为0.64，表明除死亡-获取时间和供体年龄对角膜内皮细胞起主要影响外，仍有其他因素影响着供体角膜内皮细胞密度。此前已有研究[19]表明不同温度对供体角膜内皮细胞活性有影响，温度越高，角膜内皮细胞存活的时间越短。此外，供体眼部疾患，如既往白内障、青光眼、玻璃体切除等内眼手术史，眼部炎症史、圆锥角膜及Fuchs角膜内皮营养不良等均可引起角膜内皮细胞丢失；供体原发病如糖尿病、高血压、慢性肾衰竭及代谢综合征等，供体死亡前呼吸机使用时间等也被认为会引起角膜内皮细胞丢失[20-21]。

除供体角膜植片在取材及保存过程中有内皮细胞的损伤，穿透性角膜移植手术过程也会造成内皮细胞损伤。因此，为了提高穿透性角膜手术的成功率，选用的供体角膜内皮细胞密度应＞2 000个/mm2，无明显形态异常，细胞结构稳定[2]。对临床供体角膜植片内皮细胞进行质量监测，分析角膜内皮细胞密度的影响因素并探究其变化规律，可以为穿透性角膜移植手术优选高质量供体材料，从而提高穿透性角膜手术的成功率。