TTF-1、CK7、p63、CK5/6免疫组化检测在低分化非小细胞肺癌分类中的应用

周文勤 闫雪波 王木子 赵红星 王炯

【关键字】 低分化非小细胞肺癌；TTF-1；CK5/6

肺癌是中国乃至世界最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均居各种癌症的首位[1-2]。非小细胞肺癌(Non small cell lung cancer NSCLC)约占肺癌总数的80%-85%，主要分为腺癌、鳞癌、大细胞癌等，不同的亚分类肺癌治疗策略不同。高分化腺癌、鳞癌通过特有的细胞形态特征鉴别诊断并不困难，中低分化鳞癌、腺癌缺乏特征性镜下表现。免疫组织化学(immunohistochemistry)是根据免疫学原理，检测组织、细胞中抗原性物质的一种技术。这种方法特异性强，敏感性高，尤其是对疾病的鉴别诊断及辅助诊断起到决定性作用[3-4]。其在对低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断是的准确率可达50%-75%。可作为低分化非小细胞肺癌亚分类的主要方式之一。本文旨在探讨免疫组化TTF-1、CK7、P63、CK5/6在低分化非小细胞肺癌亚分类中应用价值。

资料与方法

一、材料与方法

收集2019年1月至2021年1月安徽医科大学第一附属医院、安徽医科大学第二附属医院、安徽省立医院通过肺穿刺或电子支气管镜活检获得病理组织经组织病理学及进一步免疫组织化学确诊的低分化非小细胞肺癌104例，其中低分化腺癌62例(59.6%)、低分化鳞癌42例(40.4%)，男81例(77.9%)、女23例(16.4%)，年龄54～86岁(平均66.22±9.76岁)，所有纳入此项研究的患者均为初次确诊低分化非小细胞肺癌患者。上述研究经三所医院伦理委员会批准(批号：LLSC20211268)，所有研究对象均获得过患者或家属知情同意。

二、试剂及方法

将活检获得的肺组织标本立即置于10%福尔马林溶液中固定，送至病理科进行常规石蜡包埋、然后切片至4 μm/片、染色，采用免疫组化SP法。将石蜡切片置于40 ℃温水展开，干燥2h，经二甲苯及梯度乙醇脱蜡1h，3%过氧化氢孵育10min，PBS洗涤5min，置于高压锅内3min进行抗原修复，然后冷却至室温，正常非免疫性动物血清封闭10min，一抗孵育，二抗孵育，滴入加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液孵化10min，PBS洗涤、显色，苏木素复染，封片，镜检。

三、结果判读

最后由两位病理组织学专家进行阅片，两位病理学专家判读结果不一致时由两位共同商议决定。随机选取处理好的切片用高倍镜视野观察。 TTF-1和p63阳性表达于细胞核，阳性为棕黄色，CK7表达于细胞膜，为棕黄色，CK5/6阳性表达位于细胞质和细胞膜，阳性表达为棕黄色.肿瘤细胞阳性率>10%为阳性，未见肿瘤细胞为阴性(见图1)。

注：a为低分化鳞状细胞癌HE染色；b为低分化腺癌HE染色；c为免疫组化P63在细胞核中阳性表达(SP×400)；d为CK5/6在细胞质和细胞膜中阳性表达(SP×400)；e为CK7在细胞膜上阳性表达(SP×400)；f为TTF-1在细胞核中阳性(SP×400)

四、统计学分析

采用SPSS20.0进行统计学分析，计数资料组间比较采用χ2检验，采用受试者工作特征曲线ROC评价TTF-1、CK7、CK5/6、P63对低分化鳞癌腺癌的诊断敏感性及特异性。P<0.05差异有统计学意义。

结 果

一、针对不同年龄、性别、肿瘤病理类型及肿瘤大小层面TTF-1阳性表达的比较有意义，CK7、CK5/6、P63阳性表达在性别、及病理类型层面差异有统计学意义(P<0.05)。余在肿瘤分期、肿瘤大小、有无淋巴结转移及有无远处转移方面TTF-1、CK7、CK5/6、P63阳性表达的比较差异均无意义(P>0.05)(见表1)。

表1 不同临床特征低分化非小细胞肺癌患者TTF-1、CK7、CK5/6、P63的阳性表达情况

二、TTF-1诊断低分化腺癌的灵敏度为87.88%、特异度为93.10%；CK7诊断低分化腺癌的灵敏度为78.94%、特异度为95.83%，两者均阳性诊断低分化腺癌的灵敏度为90.91%、特异度为96.55%；CK5/6诊断低分化鳞癌的灵敏度为93.55%、特异度为93.55%；P63诊断低分化鳞癌的灵敏度为83.33%、特异度为96.15%，两者均阳性诊断低分化鳞癌的敏感性为96.66%、特异度为90.91%(见表2、表3、图2)。

表2 TTF-1、CK7阳性诊断低分化腺癌的灵敏度、特异度的ROC曲线表

表3 CK5/6、P63阳性诊断低分化鳞癌的灵敏度、特异度的ROC曲线表

图2 免疫组化检测对低分化腺癌及低分化鳞癌诊断敏感度、特异度的ROC曲线表

注：A为TTF-1、CK7单独或联合诊断低分化腺癌的ROC曲线；B为CK5/6、P63单独或联合诊断低分化腺癌的ROC曲线

讨 论

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，据统计2018 年中国新发癌4285033例，约占全球概念癌症发病的23.7%，而肺癌的发病率及死亡率均为中国排名前五位肿瘤发病率及死亡率的首位[5-6]。大部分肺癌首次确诊是已处于肿瘤中晚期阶段，总生存率仅为5%-15%[7-8]。肺癌病理学可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌约占肺癌的80%，主要包括腺癌、鳞癌、大细胞癌等。针对肺癌的治疗，早期肺癌(I、II期)主要通过手术治疗，针对晚期肺癌(III期、IV期)大多已失去手术机会[9]，主要以放疗、化疗、靶向及免疫治疗为主[10-13]。不同的亚分类肺癌治疗策略各不相同。分化良好的腺癌与鳞癌因病理学形态不同很容易区分，而分化差的非小细胞肺癌显微镜下很难区分而影响后续治疗方案的选择，免疫组化法检测成为低分化非小细胞肺癌亚分类的重要鉴别诊断的方法之一[14]。TTF-1、CK7、CK5/6及p63因其细胞来源不同及表达部位不同而成为非小细胞肺癌亚分类的新的诊断标记物[15]。

甲状腺转录因子1(TTF-I)主要表达于甲状腺上皮及肺、子宫、卵巢、乳腺和结直肠的腺癌组织中，极少表达于肺鳞癌及非典型类癌，对肺腺癌的诊断敏感性较高，因此成为肺腺癌常用的免疫标记物[16]。

细胞角蛋白7(CK7)是移行上皮及腺上皮中的碱性角蛋白，分子量较小，通常在腺癌、卵巢癌、肺癌和乳腺癌上皮癌中常呈阳性表达，在鳞状上皮中不表达，对肺腺癌的诊断敏感性较高[17]。

细胞角蛋白5/6(CK5/6)在鳞癌或鳞状上皮细胞的细胞膜和细胞质中阳性表达，在腺癌中几乎不表达，因此可用于鳞癌与腺癌的鉴别诊断[18]。

P63是P53基因家族成员之一，是重要的细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶，主要表达与鳞状上皮细胞中，少量表达与腺癌组织中[19]。

国内张堃[20]等人的研究中，TTF-1、CK7主要用于诊断肺腺癌，阳性率分别为92.16%、98.04%,本研究中TTF-1、CK7在低分化腺癌中的阳性表达率分别为91.9%和93.3%，与既往研究结果基本一致。本研究中CK5/6、P63在低分化腺癌的阳性率分别为11.1%，20.0%，在低分化鳞癌中的阳性表达率分别为92.9%和97.1%，与张爱丽等人[21]的研究结果基本一致。有文献报道TTF-1诊断腺癌的敏感性为87.7%、特异性为85.6%，P63诊断鳞癌的灵敏度100%、特异度为96%，本次研究中TTF-1诊断低分化腺癌的灵敏度为87.88%、特异度为93.10%；CK7诊断低分化腺癌的灵敏度为78.94%、特异度为95.83%；CK5/6诊断低分化鳞癌的灵敏度为93.55%、特异度为93.55%；P63诊断低分化鳞癌的灵敏度为83.33%、特异度为96.15%，且TTF-1、CK7阳性两项联合诊断低分化腺癌的敏感性及特异性均高于独诊断的敏感性特异性。TTF-1、CK7在低分化腺癌中的表达高于在低分化鳞癌中的表达，且TTF-1的表达受到肿瘤分期的影响。而肿瘤的分期、大小、有无淋巴及转移等特征对TTF-1、CK7、CK5/6、P63的阳性表达无明显影响，与既往研究结果基本一致[22-23]。

综上所述，免疫组化分子标记物单独或联合检测在低分化非小细胞肺癌鉴别诊断中具有重要意义。