调节性T细胞在结核免疫调控中的研究进展

高卫卫 邓常文 朱晓萍

2020年10月14日，世界卫生组织(WHO)发布了《2020年全球结核病报告》，全球结核菌潜伏感染人群接近20亿，结核(tuberculosis, TB)病仍是全球前10位死因之一，是人类面临的公共卫生挑战[1]。TB的重要病理特征是人感染结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis, Mtb)后，在肺部形成结核性肉芽肿，结核性肉芽肿由先天性和适应性的宿主免疫细胞共同组成，其通常由坏死性酪蛋白为中心，周围包绕失去吞噬能力的上皮样细胞及多核巨细胞以及外围由一层淋巴细胞、成纤维细胞、中心粒细胞和自然杀伤细胞围绕组成[2]。CD4+T淋巴细胞是结核性肉芽肿参与获得性免疫反应的主要细胞，在结核性肉芽肿的适应性免疫应答中处于核心地位，它通过不同的细胞亚群参与结核的免疫反应[3]。机体主要通过效应T细胞(effector T cell, Teff)发挥免疫防御作用，该防御反应在遏制Mtb的进一步扩散中起重要作用，但同时也会因较强的免疫防御反应对肉芽肿造成附带损害[4]，因此，需要免疫调节细胞——调节性T(regulatory T cell, Treg)细胞参与的免疫抑制反应。Treg是具有免疫抑制功能的CD4+T细胞亚群，主要通过抑制Teff的功能发挥免疫调节作用。近年来，越来越多的研究结果表明Treg在调节结核性肉芽肿的免疫稳态中起重要作用。因此，进一步认识Treg在结核性肉芽肿中的免疫调控作用，对阐述结核病的发病机制有重要作用。本文通过对Treg细胞的功能及其在结核性肉芽肿中的免疫调节作用进行总结与分析，阐述Treg细胞在TB发病机制中的研究进展，以期为结核病的发病机制和诊疗提供新的思路。

Treg细胞的简述

受抗原及细胞因子的刺激，初始CD4+T细胞进一步分化为Th1、Th2、Th17与Treg细胞，从而发挥不同免疫功能。Treg是一种具有独特免疫调节功能的T淋巴细胞亚群，它通过抑制Teff及抗原提呈细胞等多种免疫细胞的功能，发挥免疫抑制作用，尽管Treg细胞仅占外周血T细胞的3%～5%，但它的免疫抑制功能对维持机体的免疫平衡、调节免疫稳态和防止过度免疫损伤非常重要。根据其发育来源的不同，Treg可分为两大类：胸腺Treg(tTreg)也经常被称为自然调节性T细胞(nTreg)，它们起源于胸腺，另一类是外周诱导Treg(pTreg/iTreg)，是由T细胞活化过程中在外周产生[4]。nTregs/tTregs可以全身性地维持耐受性和体内稳态，但pTreg/iTregs则主要针对局部过度的炎症反应。叉头状/翼状螺旋转录因子P3(Foxp3)是Treg细胞最特异的标记物和主要的调节转录因子，是Treg实现其免疫调节作用的关键因子[2，5]。

Treg细胞在Mtb感染过程中的作用

Mtb感染机体的结局因宿主免疫反应的不同而不同。进入肉芽肿内的Mtb一部分被单核巨噬细胞、NK细胞等天然免疫细胞识别及消灭，同时具有抗原提呈功能的细胞，如抗原提呈细胞、树突状细胞、巨噬细胞将信号提呈给适应性免疫细胞(主要为T、B淋巴细胞)启动适应性免疫反应杀灭Mtb，但也可能造成肉芽肿的自身免疫损伤。结核性肉芽肿怎样调动较强的免疫反应来有效地控制Mtb播散，而又不会造成肉芽肿的自身免疫损伤，这就体现了免疫平衡的重要性。Treg细胞参与结核性肉芽肿的免疫调控，对维持结核肉芽肿免疫稳态必不可少。

一、Mtb感染的动物模型Treg细胞的作用研究

大量Mtb感染的动物研究结果表明，与正常对照组相比，在Mtb感染的动物模型外周血中Treg水平明显升高，同时，Treg细胞水平表达量及作用，因疾病感染时期的不同而不同。Liu等[6]分别通过M.bovis和BCG感染小鼠的体内实验研究结果显示，BCG感染小鼠体内Treg水平是空白对照组的2倍，而M.bovis感染的小鼠体内Treg水平，相当于空白对照组的2.5倍。Ozeki等[7]通过单克隆抗体干预Treg细胞的小鼠研究发现，与野生型小鼠相比，实验组小鼠在Mtb感染的第3周，Mtb负荷量及肺部肉芽肿的形成最多，而在感染的第5周，Mtb负荷量及肺部肉芽肿的形成与对照组相仿，说明Treg在Mtb感染的早期对机体控制感染是不利的，但到后期，其免疫抑制作用逐渐消失。Shafiani等[8]通过李斯特菌感染的小鼠模型的研究结果支持Ozeki等的研究，他们发现，Mtb感染的小鼠外周血Tregs的增殖也是在Mtb感染后的第3周达到高峰。Cardona等[9]通过给C3HeB/FeJ小鼠口服接种热灭活的M.manresensis(非结核分枝杆菌的一种类型)，2周后发现小鼠体内Tregs水平明显增加，而且Tregs通过在肺部产生IL-10从而降低肺部肉芽肿浸润和促炎因子(TNF-α，IFN-γ，IL-6和IL-17)的产生从而减轻肺部炎症反应。IL-35是一种抑制炎症的细胞因子，主要由Treg细胞产生，Chen等[10]通过牛分枝杆菌BCG感染的小鼠模型中发现，Mtb感染小鼠外周血、脾脏、骨髓和肺组织单核细胞中IL-35的Ebi3和p35(编码IL-35的基因)的mRNA表达升高，并且IL-35的水平随Th1/Th17的下调和Foxp3+Treg水平的增加而增加，从而间接说明Mtb感染可导致机体Treg细胞水平升高。Treg不产生IL-2，但IL-2在Treg的发育和增殖方面发挥重要的作用，补充IL-2能显著增加Treg细胞水平[11]，Chen等[12]通过IL-2干预慢性Mtb感染期的猕猴动物实验发现，实验组动物体内Tregs水平增加，同时肺部病理炎症反应减轻，这表明在慢性Mtb感染过程中，高水平的Tregs有助于控制过度的Mtb引起的炎症反应。上述大量的动物研究结果均表明，Treg细胞参与Mtb的体内免疫反应，同时，Treg参与Mtb的免疫反应因感染的不同时期其发挥的免疫作用不同，主要表现为在Mtb感染早期，对机体免疫功能的抑制，这对控制Mtb播散是不利的，但该免疫抑制功能到感染后期，其作用逐渐消失。所以，通过检测Tregs的表达量有望为结核病诊断以及评估结核病感染的不同时期提供依据。

二、人体Mtb感染研究中Treg细胞的作用

与动物实验研究结果一致，大量的临床研究结果显示，Mtb感染可导致结核患者外周血Tregs水平明显增加，同时，Tregs水平的表达量随Mtb细菌负荷量增加而增加。Ritika等[13]通过流式细胞学技术检测肠结核与克罗恩病患者外周血Treg细胞的对比研究结果显示，肠结核患者外周血Tregs水平相当于克罗恩病患者外周血Tregs水平的2倍(40.9%vs.24.9%)，同时外周血Tregs水平比例>31.35%对肠结核的诊断敏感性和特异性分别为83%和82.6%。He等[14]的临床研究发现，与健康对照组相比，肺结核患者外周血中Tregs水平明显增加，同时，痰培养或痰涂片阳性患者外周血Tregs明显高于培养或涂片阴性的患者，而随着抗结核治疗、细菌负荷量减少，Tregs也随之下降，说明Tregs水平随Mtb细菌负荷量增加而增加。Semple等[15]的进一步研究结果显示，活动性肺结核患者外周血及支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage，BAL)中Tregs水平均高于潜伏结核病患者。Ahmed等[16]的研究结果发现，虽然肺结核患者和健康对照组外周血Tregs水平无差异，但肺结核患者Treg免疫抑制功能明显强于对照组。高龄是罹患结核的高危因素之一，Namdeo等[17]通过老年肺结核的临床研究表明，老年人易感肺结核是因其外周血Treg数量的增加后抑制Mtb特异性效应T(Th1)细胞的免疫功能而导致。以上人体研究均表明，Mtb感染可诱导外周血Treg细胞水平增加，从而参与结核的免疫调节，所以，通过检测患者外周血Treg细胞水平可能成为结核病诊断与鉴别诊断的一种新方法[18]。Tregs水平不仅在结核患者的外周血中升高，有研究发现，在同一结核患者体内，Tregs在结核靶病灶中的表达量的明显高于外周血。大量的研究发现[19-20]，结核患者体内靶病灶处(结核性胸膜炎患者的胸水和肺结核病灶处)Treg细胞水平，他们发现，相对于外周血，Tregs水平在结核性胸膜炎患者胸水和肺结核病灶处支气管肺泡灌洗液中的表达量均高于外周血。Sahmoudi等[21]通过淋巴结结核患者的研究同样支持上述观点，他们发现淋巴结结核患者淋巴结中Tregs水平高于外周血，靶病灶中Treg的升高，进一步说明Treg在参与局部炎症反应中具有重要作用。结核性肉芽肿是结核病的典型病理结果，也是机体在Mtb感染后各类细胞参与形成的免疫微环境，其主要的病理特征为渗出、增殖及坏死，不同的病理表现形式，其参与该肉芽肿的不同免疫细胞不同，Treg作为一类重要的免疫调节细胞，其最主要的机制是抑制效Teff的功能，所以，以Treg细胞在结核性肉芽肿局部微环境的免疫调控为突破口，针对结核性肉芽肿Treg表达量、Treg细胞功能以及Treg/Teff比例的研究有望为结核病发病机制的进一步研究提供思路。

Treg细胞参与结核免疫的具体机制

近几年，Treg在抗TB作用的机制被广泛研究，其中最主要的机制是抑制Teff的功能。在TB的免疫反应中，Teff及Treg细胞向病理部位的募集并参与TB的炎症反应对TB的免疫调节至关重要，Treg/Teff的平衡决定局部处于促炎状态或抑炎状态，最终决定着感染的结局[22]。Sharma等[23]通过研究不同类型肺结核患者发现，Treg对Teff的抑制作用，可能决定结核的不同临床表现，如局限型表现形式为主的结核性胸膜炎、淋巴结结核，播散型的表现形式的血行播散型肺结核。Treg对Teff的抑制作用可归纳为以下四类[2]：①促使Teff细胞凋亡；②通过释放抑炎因子抑制Teff细胞功能；③直接接触杀伤Teff细胞；④调节DC成熟和/或功能的改变间接杀伤Teff(见图1)。

图1 Treg抑制Teff功能的具体机制

Treg对Teff的抑制作用可归纳为以下四类：①促使Teff细胞凋亡；②通过释放抑炎因子抑制Teff细胞功能；③直接接触杀伤Teff细胞；④调节DC成熟和/或功能的改变间接杀伤Teff。

一、促使Teff细胞凋亡

抗凋亡细胞因子诱导的Akt1信号通路是细胞抗凋亡的重要机制[24]，Treg通过促使凋亡蛋白Bad活性增强从而促使Teff细胞凋亡。正常情况下，Teff的程序性凋亡受其细胞内凋亡蛋白Bad控制，磷酸化的Akt1能有效地使凋亡蛋白Bad失活从而保持细胞存活。Pandiyan等[25]的体外细胞实验结果显示，体外共培养Treg与Teff细胞后72小时后，通过电子显微镜观察到Teff细胞大量凋亡(细胞核浓缩和细胞膜“起泡”现象)及细胞免疫学功能的改变(Teff细胞表面活性蛋白CD25+表达量减少)，说明，Treg可促使Teff细胞凋亡，进一步的研究发现，Treg通过促使凋亡蛋白Bad的活性增强从而促使Teff细胞凋亡。Gao等[26]通过体外肝癌细胞试验发现，Treg通过竞争性消耗Teff细胞生长因子IL-2而导致Teff凋亡，Treg细胞不产生IL-2，但它可通过高表达IL-2受体α竞争性消耗Teff细胞生长因子IL-2而使Teff因缺乏生长因子而凋亡。因此，进一步研究结核性肉芽肿免疫微环境中Treg与Teff的相互作用、Treg/Teff平衡状态，以及共培养中Treg与Teff功能的变化，可能为进一步研究Treg在结核的免疫微环境中的作用提供研究方向。

二、通过释放抑炎因子抑制Teff细胞功能

Treg细胞在参与TB的免疫反应中，能分泌大量的抑制性细胞因子，主要包括白细胞介素10(interleukin 10, IL-10)、IL-35和转化生长因子β(transforming growth factor β, TGFβ)等[2,16,27]。该三类炎症因子均具有维持Treg内环境稳态的作用。IL-10主要通过抑制促炎因子IFN-γ和TNF-α，下调抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)MHC-Ⅱ表达从而减少APC提呈给Teff的信号来抑制Teff的免疫反应。所以，Cardona等[28]的研究提出，可通过调节体内IL-10来调整机体的免疫平衡。Foxp3是Treg实现其免疫功能的重要胞内抑制性分子，Foxp3与其表面的抑制性蛋白NFATs形成复合体是Treg调控免疫抑制功能的关键。Giri等[29]等通过分离白癜风患者的T淋巴细胞，在体外与Treg细胞共培养的研究中发现，Treg是通过表达其抑制性蛋白NFATs与Foxp3来抑制CD4+与CD8+T淋巴细胞的功能。Zhang等[30]的研究结果显示，在Mtb抗原刺激下，Foxp3+Treg细胞在局部肉芽肿组织的高表达同时促使产生IL-35的B细胞浸润参与肉芽肿的免疫调控。不仅如此，Treg还可表达抑制性分子CD39和CD73参与Teff的抑制功能。CD39是一种外切核酸酶，它将ATP或ADP转化为AMP，它通过消除炎症介质ATP和增加腺苷的产生，从而抑制Teff抗炎症反应中所需要的ATP或ADP从而抑制Teff的功能[31]。Gu等[32]通过分离体内CD39hiTregs和CD39lowTregs发现，CD39hiTregs可以保持稳定的Foxp3表达分泌较多的IL-10(TGF-β无变化)而具有较强的抑制活性，而CD4CD39lowTreg失去Foxp3表达并转分化为Th1或Th17细胞。CD73可上调Teff相应受体-嘌呤能腺苷受体(adenosine-purinergic adenosine receptor, A2A)的表达并与其结合来实现其免疫抑制功能，但具体机制目前仍不清楚。因此，来自CD39敲除小鼠的Treg细胞在体外表现出受损的抑制特性[33]。Treg与Teff在分子水平上的相互作用较为复杂，这也为研究它们在结核分子免疫调控中提供研究空间，通过对上述细胞分子层面上的进一步研究，将为结核分子免疫探究提供理论依据。

三、直接接触杀伤Teff

也有少数研究显示，Treg可通过直接接触杀伤Teff细胞来实现其免疫抑制作用。颗粒酶属于细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞质颗粒中的丝氨酸蛋白酶家族，它们通过穿孔素孔进入靶细胞，裂解并激活细胞内胱天蛋白酶，导致靶细胞凋亡。穿孔素是溶酶颗粒的一种成分，参与质膜的透化作用，促使颗粒酶和其他细胞毒性成分进入靶细胞。Gondek等[34]通过体外共培养Treg与Teff实验发现，Treg可通过依赖颗粒酶A、颗粒酶B和穿孔素而直接杀伤Teff细胞。Sun等[35]通过在大肠癌的肿瘤微环境的研究发现，浸润于肿瘤微环境中的Foxp3+Treg除了表达抑制性细胞因子之外，还可高表达颗粒酶B，来减弱促炎细胞的免疫功能从而减轻肿瘤组织的炎症反映。

四、调节DC成熟和/或功能的改变间接抑制Teff的功能

树突状细胞(dendritic cell，DC)是专业的抗原提呈细胞 (Antigen-presenting cells, APC)，是调节先天免疫和适应性免疫反应之间的桥梁细胞，它在启动和调节抗原特异性T细胞的免疫反应中起关键作用[6]。Treg通过表达共刺激分子如淋巴细胞激活基因-3(LAG3)、细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、CD80、CD86介导DC诱导吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)(IDO是一种抑制分子，可以从色氨酸的分解代谢中诱导促凋亡代谢产物的产生促使细胞凋亡)的产生来调节DC的成熟和功能的改变间接抑制Teff的功能[36-37]。Oderup等[38]通过使用CTLA4特异性阻断抗体或缺乏CTLA4的Treg细胞株实验研究表明，缺乏CTLA4的Treg细胞，DC产生IDO量明显减少，由DC介导的Teff抑制作用也随之降低。但Treg的该间接抑制Teff的功能研究较少，可能因Treg该2方面的功能相对较弱，也可能是目前Treg在该方面的研究较少。

综上所述，大量体外细胞实验、体内动物及临床研究结果均表明，Treg参与Mtb感染的免疫调控，同时，结合临床中的一个重要发现—Treg在靶病灶中表达量明显高于外周血，我们相信，将结核性肉芽肿的免疫微环境作为研究对象，通过对该免疫微环境中Treg的表达量、细胞功能以及Treg/Teff免疫平衡的进一步研究有望为结核病发病机制研究提供思路。