脱除游离棉酚乳酸菌的分离鉴定及益生性能研究

吴慧昊， 舒文秀， 刘梓琦， 李姿茹， 徐红伟， 周 瑞， 臧荣鑫*

(1.西北民族大学 实验教学部，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

我国优质蛋白饲料原料严重短缺，每年饲料资源需求量达3.5亿t，其中进口量占需求量1/3左右[1]。棉籽为棉花的种子，棉籽经过压榨、浸出工艺，分离出所含油脂，得到的残余物为棉粕，其蛋白含量高达36.3%～47.0%，并富含多种维生素，是制作饲料的主要原料[2-4]。虽然棉粕蛋白含量高，营养价值好，但棉粕中含有内源性毒素—游离棉酚，能造成动物内脏受损、繁殖能力下降等毒害作用，因此限制了棉粕作为饲料在动物生产中的应用[5-8]。为了减少棉粕中游离棉酚的含量，改善棉粕饲料的营养品质，解决我国蛋白饲料短缺的问题，许多专家学者对棉粕脱毒处理进行了研究，如物理脱毒法[9-11]、化学脱毒法[12-13]和微生物处理法[14]。微生物处理法成本低、安全性高，并且可以提高棉粕中蛋白质、必需氨基酸含量，改善饲料适口性，近年来常被用于棉粕脱毒。目前，微生物处理法常用菌种有黑曲霉、土曲霉、假丝酵母、芽胞杆菌等[15-18]，但绝大部分菌种不是农业部允许用于饲料添加剂的微生物菌种。乳酸菌在自然界分布广泛，被美国食品药品监督局认定为GRAS等级的食品微生物，乳酸菌有很多益生功能，如调节肠道菌群、抑制肠道致病菌的生长繁殖，提高饲料消化率，改善饲料的口感和风味[19-21]。本研究通过分离高效游离棉酚脱除乳酸菌菌株，并对菌株的益生性能进行研究，以期为棉粕微生物脱毒提供优良菌株，为棉粕在畜禽生产中的合理利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 样品藜麦植株采自甘肃省甘南藏族自治州临潭县流顺乡。

1.1.2 培养基 ①MRS培养基：参照亓秀晔等方法配制[22]；②降解棉酚选择培养基：(NH4)2SO45 g，KH2PO41 g，CaCl21 g，MgSO40.5 g，酵母粉 0.2 g，NaCl 0.1 g，醋酸棉酚 0.3%，pH值6.5～6.8，琼脂17 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min； ③棉粕固态培养基：称取经粉碎过 60目筛的棉粕 84.1 g，麸皮9.4 g，红糖6.5 g于500 mL发酵袋中，121 ℃灭菌20 min，待冷却后加入无菌水66 mL备用。

1.1.3 主要试剂与仪器设备 葡萄糖、酵母浸粉、牛肉浸粉、琼脂粉、药敏试纸均购自杭州微生物试剂有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶购自上海国药集团化学试剂有限公司；DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。全自动高压灭菌器(MLS-3750，日本三洋公司)；高速冷冻离心机(GL-21M，赛特湘仪离心机仪器有限公司)；数码光学显微镜(BX51T-32P01，日本奥林巴斯公司)；生物安全柜(1285，美国热电公司)；紫外可见分光光度计(UV-2450PC，日本岛津公司)；新型电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9140A，宁波江南仪器厂)；电热恒温培养箱(HH.B11.600-BS-II，上海跃进医疗器械厂)；电泳仪(DYY-12，北京市六一仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 菌种的分离、纯化 称取5 g藜麦茎叶样本，剪碎装入50 mL无菌生理盐水中，于250 mL三角瓶中摇床震荡20 min摇匀，静置备用。采用梯度稀释涂平板法进行菌种分离，连续划线纯化菌种。

1.2.2 游离棉酚脱除乳酸菌的初筛 将分离纯化的菌株点种在降解棉酚选择培养基上，37 ℃恒温培养72 h，观察其菌落生长情况。每个平板3个重复，取其平均值。

1.2.3 游离棉酚脱除乳酸菌的复筛 将初筛后具有棉酚脱除作用的菌株活化后，取3 mL接种于棉粕固态培养基，充分混合均匀，37 ℃静置发酵72 h。发酵结束，检测发酵物的pH值、乳酸含量及发酵风味等，将棉粕固态培养基于45 ℃烘干24 h，最终检测各菌株的棉酚脱除效果，每组处理3个重复。乳酸含量测定参照 GB/T 12456-2008的方法，棉酚含量测定参照 ISO 6866-1985《游离棉酚和总棉酚的测定》方法。

1.2.4 乳酸菌株酸、胆盐耐受实验 调整菌液活菌数为108cfu/mL，按4%(体积分数)的接种量接入pH值分别为1、2、3(胆盐质量浓度分别为0.3、1.5、3.0 g/L)的MRS液体培养基中，37 ℃静置培养4 h，吸取菌悬液，梯度稀释涂平板，37 ℃恒温培养48 h，选取菌落数30～300之间的平板计数，每组处理3 个重复，求平均值。酸(胆盐)耐受力(%)=(Nt/N0)×100%。式中，Nt为4 h各梯度培养基活菌数(cfu/mL)；N0为0 h各梯度培养基的活菌数(cfu/mL)。

1.2.5 乳酸菌株人工胃液、肠液耐受实验 调整菌液活菌数为108cfu/mL，按4%(体积分数)的接种量分别接入人工胃液、人工肠液中，培养结束吸取菌悬液，进行梯度稀释，涂布至MRS固体培养基，37 ℃恒温培养，选取菌落数30～300之间的平板进行计数，每组处理3 个重复，求平均值。计算菌株对人工胃液、肠液的耐受力。人工胃液的配制参见刘秀侠等方法[23]。人工肠液的配制参见李文等方法[24]。人工胃液(肠液)耐受力(%)=(Nt/N0)×100%。式中，Nt为各时间段培养基活菌数(cfu/mL)；N0为0 h培养基的活菌数(cfu/mL)。

1.2.6 乳酸菌株表面特性 ①表面疏水性测定：取乳酸菌种子液8 000 r/min离心10 min，弃上清，PBS缓冲液洗涤菌体3次，调整菌悬液OD600为0.8。试管中加入4 mL菌悬液、1 mL正己烷，对照组不加正己烷，旋涡振荡仪振荡60 s，静置15 min至液体分层。吸取下相水溶液3 mL，以PBS缓冲液为空白对照，在600 nm波长下测定其吸光度，细菌细胞表面疏水性(CSH)按公式计算: CSH(%)=((A0-AS)/A0)× 100%。式中，A0为对照组光密度值；AS为实验组光密度值。②表面凝集性测定：取5 mL按1.2.6①所述方法调整好菌液浓度的菌悬液，于37 ℃恒温培养2 h，吸取200 μL上层悬浮液，不摇动，600 nm波长下测定OD值。A(%) =((OD0-ODt)/OD0)×100%。式中，OD0为菌悬液初始光密度值；ODt为静置后光密度值。

1.2.7 乳酸菌株抑菌、耐药实验 采用牛津杯法进行菌株抑菌实验，具体参照吴慧昊等方法[25]。采用K-B(药敏纸片琼脂扩散法)观察菌株的抗生素耐药性，具体参照赵雪婷等方法[26]。

1.2.8 乳酸菌株鉴定 采用微量生化反应管及16S rDNA法对目标菌株进行鉴定，确定目标菌株种属。使用Solarbio的DNA试剂盒提取菌株DNA并用1492 R引物对其进行PCR扩增。扩增产物送至大连美仑生物技术有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌株分离、纯化结果

从样品中分离得到13株乳酸菌，菌落大小约1～3 mm，呈圆形，边缘规则整齐，颜色多数呈白色、乳白色，菌落周围产生透明CaCO3溶解圈，菌株革兰染色阳性，镜检菌株大部分呈杆状，个别呈球状，菌体大小约为(0.5～1.5) μm×(1.5～2.5) μm。菌落形态见表1。

2.2 游离棉酚脱除乳酸菌的初筛结果

将分离纯化的菌株进行初筛，菌株的生长情况见表2。由表2可知，只有乳酸菌株ZY-C.001、ZY-BM.001和LR002在降解棉酚选择培养基上生长，其余菌株均不生长，选取生长较快较好的乳酸菌ZY-BM.001和LR002进行复筛。

表1 乳酸菌菌落形态特征

表2 游离棉酚脱除乳酸菌株初筛结果

2.3 游离棉酚脱除乳酸菌的复筛结果

如表3所示，从产酸性能上看，乳酸菌LR002和ZY-BM.001与对照组均存在显著差异(P<0.05)，总体的产酸性能较好，乳酸含量在24 g/kg以上，pH在3.4～3.7之间，可以满足菌种产酸要求。从风味评价上看，虽然乳酸菌ZY-BM.001 的产酸性能好，但其发酵产物酸气刺鼻，令人不快，不能达到改善棉粕风味的要求，而乳酸菌LR002的 pH适中，发酵产物酸香适中，风味柔和，其挥发性气味有轻微酯香，可满足改善棉粕风味的要求。

由试验可知，不加任何菌株的对照组，其自身所含游离棉酚会有所降低，这主要是因为棉粕固态培养基经过灭菌、高温高压对游离棉酚有脱除作用，这一结论也与徐晶等[27]、贾晓峰等[28]的研究结果一致。与对照组相比，乳酸菌LR002和ZY-BM.001对于游离棉酚的脱毒率存在显著差异，且乳酸菌LR002游离棉酚的脱除率高于乳酸菌ZY-BM.001，脱毒率达到62.87%，因此，选取乳酸菌LR002进行后续益生性能研究。

表3 游离棉酚脱除乳酸菌株复筛结果

2.4 乳酸菌LR002酸、胆盐耐受实验结果

由图1可知，乳酸菌LR002在pH值为1的培养基中培养4 h，生存受到限制(P<0.05)，随着pH值的升高，其存活率逐渐提高，当pH值3，培养4 h时，乳酸菌LR002表现出很好的耐酸性能(图1)。微生物在生长过程中胆盐浓度高低会对其产生影响，当浓度较高时会抑制菌体生长，小肠正常状态下胆盐质量浓度为0.3～3.0 g/L，乳酸菌LR002在低胆盐浓度条件下，4 h后出现了生长情况，生长完全不受影响。当胆盐浓度为1.5和3.0 g/ L时，其菌株生长出现一定程度下降，但在高胆盐浓度情况下4 h后，乳酸菌LR002的耐受力菌株生长均保持在90%以上，表现出很好的胆盐耐受能力(图2)。

图1 乳酸菌LR002耐酸试验Fig.1 Effects of different acidity on the growth of strains图中不同小写字母表示存在显著差异(P<0.05)，下图同Different letter indicate significant differences (P<0.05), below same

2.5 乳酸菌LR002耐人工胃液、肠液实验结果

食物进入胃中一般停留4～5 h后排空，因此，菌株要在动物体内发挥益生效果，需要对胃液有一定耐受性。如图3所示，乳酸菌LR002在人工胃液中培养2 h，生长受到一定的抑制(P<0.05)，但随着培养时间的延长，该菌株对胃液环境的适应性增强，出现了生长情况。从图4可以看出，乳酸菌LR002随着培养时间的增加出现生长情况，对人工肠液同样有较好的耐受性(P<0.05)，提示乳酸菌LR002可在肠道里生长繁殖并发挥其益生性能。

图2 乳酸菌LR002胆盐耐受试验Fig.2 Tolerance of Lactic acid bacteria LR002 to bile salts

图3 人工胃液耐受试验Fig.3 Tolerance of the strains to mimic stomach juice

2.6 乳酸菌LR002菌表面特性实验结果

乳酸菌LR002要具备较好黏附于宿主肠壁细胞的能力，避免因肠道蠕动而无法有效定殖[29]。乳酸菌LR002只有有效定殖才能发挥其益生功能，能否较好地黏附并定殖于肠道内取决于菌株的表面特性，经试验发现(表4)，乳酸菌LR002的表面疏水性为53.43%，表面凝集性为44.38%，该菌株能较好黏附到肠道上皮细胞和黏膜表面，发挥其益生功效。

图4 人工肠液耐受试验Fig.4 Tolerance of the strains to simulated intestinal fluid

表4 乳酸菌LR002的表面特性

2.7 乳酸菌LR002抑菌、药敏实验结果

益生菌进入肠道内可以抑制病原菌的生长，形成肠道保护，对肠道结构和微生态平衡有着积极作用。经实验发现，乳酸菌LR002对4种致病菌均产生抑制作用，具有广谱抑菌作用(表5、图5)。由表6可知，乳酸菌LR002对大部分抗生素表现为耐药，对头孢噻肟、美满霉素、氧氟沙星三种抗生素敏感，益生菌进入肠道中，其自身的耐药性对其存活具有积极意义，该菌株对长期使用的青霉素、庆大霉素等常用抗生素具有耐药性，这也提高了其在肠道中的生存能力。

表5 乳酸菌LR002对指示菌的抑制作用

图5 乳酸菌LR002抑菌效果Fig.5 The bacteriostatic effect of Lactic acid bacteria LR002

2.8 乳酸菌LR002生理生化及16S rDNA鉴定结果

乳酸菌LR002为革兰阳性菌，菌株在半固体培养基中垂直生长，无运动性(图6、图7)，菌株硝酸盐还原实验、接触酶实验均为阴性，鼠李糖、棉子糖发酵实验为阴性，具体生理生化实验结果见表7。

表6 乳酸菌LR002药敏实验结果

图6 菌落形态 Fig.6 Colony morphology

表7 生理生化鉴定结果

提取乳酸菌LR002 DNA，并进行16S rDNA扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图8。将扩增产物进行测序，提交菌株的16S rDNA序列在NCBI数据库中进行比对，采用Neighbor-Joining构建系统发育树，结果显示，乳酸菌LR002在系统发育树上与Lactobacilluspla-ntarumstrain NOS 7318聚为一簇(图9)，具有较近的进化距离，因此结合生理生化特征，鉴定乳酸菌LR002为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。

图7 革兰染色 Fig.7 Gram′s staining results

图8 16S rDNA基因扩增产物Fig.8 16S rDNA gene PCR amplication

图9 乳酸菌LR002与相关菌株的系统发育树Fig.9 Phylogenetic tree of LR002 and related strains

3 讨 论

从甘肃省甘南藏族自治州临潭县藜麦植株分离得到一株降解棉酚乳酸菌LR002，经鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。微生物发酵脱毒，关键在于菌种及发酵条件，而菌种选择是重中之重。龙良雨[30]通过筛选得到一株高效降解游离棉酚的红曲霉菌株，游离棉酚降解率为72.5%。包慧芳[31]筛选得到的假丝酵母G3，棉酚降解率为69.5%。周媛媛[32]从棉花种植基地土壤及羊瘤胃液中筛选出降解游离棉酚菌株红平红球菌RE-1及黑曲霉AN-1，其降解率分别达到81.0%和76.08%。王春芳等[33]采用黑曲霉生料发酵棉粕，脱毒率达到 61.59%。以上所述菌株绝大多数不是农业部允许用于饲料添加剂的微生物菌种，并且各种霉菌产生的孢子易污染环境且可能产生毒素，对动物和人体都有不利影响。目前，对于乳酸菌脱毒效果的研究主要集中于混菌发酵。陈生琴[34]利用混菌发酵棉粕，当红平红球菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌接种比例为1∶2∶2时，游离棉酚的降解率最高达到为81.6%。亓秀晔等[22]利用枯草芽胞杆菌BLCC1-0039和植物乳酸菌BLCC2-0092复配厌氧发酵棉粕72 h，游离棉酚脱除率达到61.58%。本研究就乳酸菌单菌在棉粕脱毒方面进行了研究，筛选的乳酸菌LR002 游离棉酚脱除率达到62.87%，经试验发现该菌株具有较好的表面特性及耐人工胃液、肠液效果，提示其可以在动物体内较好定殖存活，发挥其益生作用。该菌株具有广谱抑菌作用，可抑制多种细菌生长，若作为饲料添加剂进入动物肠道，可有效抑制肠道中有害菌的生长，具有整肠作用。乳酸菌LR002对常用抗生素具有耐药性，可提高其在肠道中的生存能力。

虽然利用乳酸菌 LR002发酵脱除游离棉酚效果较好，经发酵后的棉粕饲料含有大量有益生作用的乳酸菌，并且经乳酸菌LR002发酵后，不仅提高了干物质和蛋白质的消化利用率 ，同时所产乳酸及芳香物质也提高了棉粕饲料的适口性，但由于乳酸菌在发酵过程中产生多种代谢物质，脱毒效果与营养的变化规律并不是很清楚，所以具体的发酵棉粕动物饲喂实验及棉粕发酵饲料在动物体内毒性实验将是下一步研究的重点。