醋酸棉酚旋光异构体的制备及其含量测定研究

周梦宇，古丽斯坦·阿不来提，李 洋，姚 军

(新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011)

关健词：醋酸棉酚；衍生化反应；旋光异构体：分离制备

棉籽为锦葵科棉属植物草棉(GossypiumherbaceumL.)、树棉(G.arboreumL.)及陆地棉(G.hirsutumL.)的种子，主要化学成分为亚油酸、棕榈酸、油酸、甾醇和棉酚等[1]。棉酚是1种倍半萜二聚体，化学结构为2个C-C单键连接的萘环[2]，其中亲脂性部位的甲基与亲水性部位的羟基取代作用，构成的空间位阻会阻碍联萘环转动，使棉酚具有旋光性，包括左旋棉酚[(-)-棉酚]和右旋棉酚[(+)-棉酚][3-4]。研究表明，棉酚具有抗肿瘤[5-6]、抗生育[7-8]等生物活性，当人体摄入大量棉酚时，会对心脏、肾脏、肝脏、卵巢等器官造成损伤[9-12]，且(-)-棉酚和(+)-棉酚的生物活性[13-15]和毒性作用也具有一定差异[16-17]。为提高棉酚类药物的治疗效果，降低其毒副作用，本研究采用丙酮-苯胺法从棉籽中制得苯胺棉酚，经乙醚溶解后在稀硫酸作用下转化，使棉酚游离出来并与冰醋酸结合的方法制备醋酸棉酚，再与手性衍生化试剂进行衍生化反应，得到醋酸棉酚旋光异构体衍生物，该衍生物经硅胶柱色谱常压分离为(-)-醋酸棉酚衍生物和(+)-醋酸棉酚衍生物，经盐酸水解反应可分别得到(-)-醋酸棉酚和(+)-醋酸棉酚2个单体，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器Agilent 1220 LC型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，MS3BS25型涡旋振荡器(德国IKA公司)，TDL-5A型低速离心机(常州金坛良友仪器有限公司)，OSB-2100型水浴锅(上海安亭科学仪器厂)，XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱(美国安捷伦公司)，GL-525-A型磁力搅拌器(上海五相仪器仪表有限公司)。

1.2 材料与试剂棉籽2016年10月购买于阿拉尔市，经新疆医科大学药学院天然药物教研室帕丽达·阿布力孜教授鉴定为锦葵科陆地棉(G.hirsutumL.)的干燥成熟种子，醋酸棉酚对照品(陕西慈缘生物科技有限公司，批号20180823)，D-(-)苏-1-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇(上海晶纯生化科技股份有限公司，批号S161025)，硅胶(北京索莱宝生物科技有限公司，批号20180907，160-200目)，无水硫酸钠(天津博迪化工股份有限公司，批号20150901)，磷酸二氢钾(天津市富晨化学试剂厂，批号20140707)，碳酸氢钠(上海虹光化工厂，批号20102731)，色谱乙腈(美国Fisher Scientific公司)，丙酮、苯胺、乙醚、硫酸、冰醋酸、无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)，石油醚(沸程30～60℃)、磷酸、四氢呋喃、环己烷、乙酸乙酯、甲醇(天津市北联精细化学品开发有限公司)，试剂均为分析纯。

1.3 醋酸棉酚的制备方法称取棉籽250 g置于具塞锥形瓶中，按料液比1∶2加入80%丙酮溶液，浸渍24 h后过滤，滤液中加入2.5 mL苯胺，室温下避光放置过夜，滤出晶体常温放置干燥；重复上述方法数次，即得苯胺棉酚10.29 g。将制备的苯胺棉酚置于烧杯中，依次加入乙醚300 mL、硫酸乙醇(摩尔比1∶1)溶液20 mL，在10℃下搅拌至溶解后置于分液漏斗中，乙醚层用600 mL超纯水洗涤至弱酸性，再加入适量无水硫酸钠干燥30 min，过滤，在滤液中加入15 mL冰醋酸，避光放置6 h后有黄色沉淀产生，滤出沉淀并置于避光处风干；在滤液中依次加入10%冰醋酸乙醚溶液20 mL、石油醚5 mL，按上述方法放置和抽滤，干燥后合并黄色沉淀，制得醋酸棉酚。

1.4 自制醋酸棉酚含量测定方法称取醋酸棉酚对照品10.50 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加入冰醋酸0.5 mL，用95%乙醇溶液定容至刻度，得浓度为1.05 mg/mL的醋酸棉酚对照品溶液。分别吸取对照品溶液适量，用95%乙醇溶液配置成浓度分别为2.15、5.38、13.44、33.60、84.00、210.00 μg/mL的醋酸棉酚溶液。色谱条件：色谱柱为XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为10 mmol/L磷酸二氢钾缓冲溶液(pH 3.0)-乙腈(27∶73)，进样量10 μL，流速1.0 mL/min，柱温35℃，检测波长247 nm。以对照品溶液浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=832 687X+316 630，r=0.999 4，醋酸棉酚对照品在2.15～210.00 μg/mL浓度范围内线性关系良好。称取“1.3”项下醋酸棉酚10.91 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，用95%乙醇溶液定容至刻度，即得醋酸棉酚样品溶液，按上述方法测定并计算自制醋酸棉酚含量。

1.5 醋酸棉酚衍生化实验分别称取“1.3”项下醋酸棉酚1.21 g、D-(-)苏-1-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇1.25 g置于250 mL锥形瓶中，加入四氢呋喃50 mL，在75℃条件下水浴回流30 min，室温冷却后得到醋酸棉酚旋光异构体衍生物溶液。吸取该溶液5 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤，按“1.4”项下色谱条件测定醋酸棉酚衍生化物反应情况，剩余溶液挥干溶剂，得到醋酸棉酚旋光异构体衍生物。

1.6 醋酸棉酚旋光异构体衍生物的硅胶柱色谱分离方法称取100 g硅胶，以环己烷为装柱溶液，湿法装柱，饱和12 h后上样。称取“1.5”项下醋酸棉酚旋光异构体衍生物2.43 g和硅胶2.53 g，加入少量环己烷溶解后旋蒸至干燥，平铺在硅胶柱顶端，干法上样。(+)-醋酸棉酚衍生物洗脱条件为乙酸乙酯∶环己烷=3∶2，(-)-醋酸棉酚衍生物洗脱条件为乙酸乙酯∶环己烷∶甲醇=8∶1∶1。取各洗脱液5 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤，按“1.4”项下色谱条件检测硅胶柱色谱分离各衍生物情况，剩余洗脱液浓缩后干燥，分别得到(+)-醋酸棉酚衍生物和(-)-醋酸棉酚衍生物。

1.7 (+)-醋酸棉酚、(-)-醋酸棉酚的制备方法称取“1.6”项下(+)-醋酸棉酚衍生物1.98 g，置于250 mL锥形瓶中，依次加入乙醚140 mL、冰醋酸10 mL、浓盐酸8 mL，45℃水浴回流4 h，1 000 r/min磁力搅拌均匀。用超纯水、1%碳酸氢钠溶液将反应液洗涤至中性，加入无水硫酸钠干燥1 h后，滤出固体并用乙醚洗涤至无色，合并乙醚洗液和滤液，浓缩，加入5 mL石油醚，避光放置过夜，有浅黄色沉淀析出，经抽滤得到(+)-醋酸棉酚。称取(-)-醋酸棉酚衍生物2.05 g，按上述流程操作，即得(-)-醋酸棉酚。

1.8 (+)-醋酸棉酚、(-)-醋酸棉酚的含量测定方法分别称取“1.7”项下(+)-醋酸棉酚5.11 mg、(-)-醋酸棉酚5.18 mg，置于25 mL棕色容量瓶中，用95%乙醇溶液定容至刻度，即得样品溶液，按“1.4”项下方法测定(+)-醋酸棉酚、(-)-醋酸棉酚的含量。

2 结果

2.1 自制醋酸棉酚含量测定结果自制醋酸棉酚样品浓度为46.98 μg/mL，根据样品称样量和稀释倍数计算，自制醋酸棉酚含量为93.3%，见图1。

(A：醋酸棉酚对照品，B：自制醋酸棉酚)

2.2 醋酸棉酚衍生化实验结果醋酸棉酚经衍生化反应生成了(+)-醋酸棉酚衍生物和(-)-醋酸棉酚衍生物，(+)-醋酸棉酚衍生物的保留时间为7.5 min，(-)-醋酸棉酚衍生物保留时间为10.5 min，在该色谱条件下(+)-醋酸棉酚衍生物和(-)-醋酸棉酚衍生物的分离度良好，见图2。

[1：(+)-醋酸棉酚衍生物，2：(-)-醋酸棉酚衍生物]

2.3 硅胶柱色谱分离结果在该色谱条件下，(+)-醋酸棉酚衍生物和(-)-醋酸棉酚衍生物的分离效果良好,见图3、4。

图3 (+)-醋酸棉酚衍生物HPLC图

图4 (-)-醋酸棉酚衍生物HPLC图

2.4 (+)-醋酸棉酚和(-)-醋酸棉酚含量测定结果由标准曲线法计算，(+)-醋酸棉酚和(-)-醋酸棉酚样品的浓度分别为44.27、45.23 μg/mL，根据(+)-醋酸棉酚、(-)-醋酸棉酚的称样品和稀释倍数，计算(+)-醋酸棉酚和(-)-醋酸棉酚样品的含量分别为90.8%、91.5%，见图5。

[A：(+)-醋酸棉酚，B：(-)-醋酸棉酚；C：醋酸棉酚对照品]

3 讨论

目前棉酚旋光异构体的分离方法主要为色谱法，包括直接法和间接法，直接法通过手性固定性的色谱柱进行HPLC分离，但其成本较高，使用范围具有一定的局限性，故本实验使用的间接法，由手性衍生化试剂进行衍生化反应，适合大批量的样品制备和工业生产。本研究采用硅胶柱色谱分离醋酸棉酚旋光异构体衍生物时，参照文献[18]选择环己烷和乙酸乙酯作为洗脱溶液，洗脱条件为：乙酸乙酯∶环己烷=3∶2、乙酸乙酯∶环己烷=4∶1；但在实际分离过程中，乙酸乙酯∶环己烷=3∶2的洗脱条件能较好的分离(+)-醋酸棉酚衍生物，而乙酸乙酯∶环己烷=4∶1的洗脱条件未能将(-)-醋酸棉酚衍生物洗脱，通过后续对洗脱条件的调整，确定洗脱条件为乙酸乙酯∶环己烷∶甲醇=8∶1∶1，在此条件下醋酸棉酚旋光异构体衍生物分离效果良好。本实验方法简便、可靠，适用于(+)-醋酸棉酚和(-)-醋酸棉酚单体的制备分离和含量测定，为后期对棉酚的研究提供了理论基础。