1株人工栽培蛹虫草病原真菌的分离鉴定及生物学特性研究

李 娟， 刘晓红， 宋 洁

(1.辽东学院 农学院，辽宁 丹东 118003；2.辽东学院 食用菌研究所，辽宁 丹东 118003)

蛹虫草(Cordycepsmilitaris(L.: Fr.)Link)，又名北虫草，属子囊菌门肉座菌目虫草科(Cordycipitaceae)虫草属(Cordyceps)[1-2]。蛹虫草子实体及菌丝体中含有虫草素、喷司他丁、虫草多糖等多种活性物质，具有抗肿瘤、抗病毒等生物活性，是珍贵的食药用真菌[3-5]。自实现人工栽培以来，蛹虫草年产量已达90 559.7 t，成为食用菌栽培产业重要的组成部分[6]。在蛹虫草规模化栽培过程中，除了菌种稳定性以外，病害已成为制约产业发展的重要因素。蛹虫草栽培过程中常见的病害有细菌病害和真菌病害，其中，95%以上为真菌病害[7]。根据边银丙[8]的分类标准，真菌引起的蛹虫草病害可分为侵染性和竞争性两种。侵染性病害是指真菌侵染食药用菌菌丝体和子实体，造成生长异常；竞争性病害通常指病原真菌侵入培养基质，与食药用菌菌丝及子实体同时生长，并与之争夺营养、水分、氧气和生长空间等，有些种类在生长过程中分泌毒素，造成食用菌菌丝生长受到抑制[9]。据报道和调查，在蛹虫草发菌和出菇阶段，常发生由木霉(Trichoderma)、镰刀菌(Fusarium)、曲霉(Aspergillus)等造成的真菌病害，这些病原菌生长速度快，产孢量大，传染能力强，通过竞争生长空间和营养物质，侵染子实体等方式，抑制蛹虫草菌丝生长和原基发生，导致子实体畸形，发育受阻，对生产造成严重影响[7，10]。本研究对蛹虫草栽培过程中发现的病原真菌进行分离鉴定，明确其生物学特性，为蛹虫草真菌病害的预防和控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 2020年7月于辽宁省丹东市元尊生物科技有限公司蛹虫草种植基地采集感染真菌的蛹虫草栽培盒，用于病原菌的分离鉴定。

1.1.2 培养基 ①PSA培养基[11]：马铃薯200.0 g，蔗糖20.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1 000 mL；②SNA培养基[12]：KH2PO41.0 g，KNO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，葡萄糖0.2 g，蔗糖0.2 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL；③小麦培养基[13-14]：小麦70%，蚕蛹粉23%，蔗糖5%，蛋白胨1.5%，酵母粉 0.5%，VB1微量，含水量60%。

1.1.3 主要试剂与仪器设备 Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0)、DNA Marker(DL2000)购自宝生物工程(大连)有限公司；引物ITS1/ITS4(ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。高压蒸汽灭菌器(YXQ-100SII，上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；超净工作台(SW-CG-2F，苏州安泰空气技术有限公司)；生化培养箱(BSP-100，上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；显微镜(ECLIPSE 50i，Nikon)；PCR仪(TP 600，TAKARA)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离与纯化 记录蛹虫草栽培料、菌丝体和子实体发病特征，采用组织分离法对病原真菌进行分离。在超净工作台中用无菌接种钩，直接挑取病原菌菌丝体，接种于PSA培养基上，置于25 ℃恒温培养箱中培养。参照余苗等[15]的方法对病原菌进行纯化，菌丝长满试管，并产生大量无性孢子后，制备孢子悬浮液，采用梯度稀释法将孢子悬浮液涂布于PSA平板，获得单孢萌发的菌落，转接至新试管，待长满试管，即获得纯化菌株，于4 ℃保藏备用。

1.2.2 致病性测定 参照刘晴等[7]方法，略有改动。以柯赫法则验证上述分离菌株对蛹虫草的致病性。蛹虫草采用常规方法栽培，病原菌菌饼用无菌打孔器(直径0.8 cm)制备。当蛹虫草菌丝长满栽培料时，将病原菌菌饼接种于蛹虫草栽培盒中，每盒接入2块。不接种病原菌的蛹虫草栽培盒为对照组，每组设置5个重复，对照组和试验组进行相同的常规管理。培养期间观察记录病原菌侵染过程。发病后，按照1.2.1中的方法再次分离病原菌，并对新分离的病原菌株和接种的病原菌进行鉴定和对比。

1.2.3 病原菌的形态学鉴定 参照贾廷祥等[16]的方法，将分离的病原菌接种于PSA培养基上，25 ℃培养5 d，观察菌落形态、颜色等特征。采用插片培养法，在SNA培养基上，将灭菌的盖玻片以45°斜插于接种块周围，定期取片进行显微观察、拍照。根据菌株培养性状，分生孢子等特征，按王拱辰等[17]和布斯[18]的分类系统进行鉴定。

1.2.4 病原菌的分子鉴定 按照试剂Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR的操作步骤提取病原菌的总DNA，略有改动。将病原菌接种在PSA平板培养基，25 ℃培养3 d，用灭菌的枪头刮取菌落尖端适量菌丝体，置于50 μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR中，80 ℃水浴15 min，5 000 r/min离心5 min，上清液留作PCR模板。采用通用引物ITS1/ITS4扩增病原菌的ITS序列，PCR反应体系(50 μL)：1×TaqPCR Master Mix 25 μL，DNA模板2 μL，引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 21 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃终止反应。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，由生工生物工程(上海)有限公司进行测序。获得的ITS序列在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对，下载同源性较高的序列，利用软件MEGA X 10.0.2进行多重序列比对，采用邻位相连法(Neighbor-joining method)构建系统发育树，Bootstrap replications设置为1 000次。

1.2.5 病原菌的生物学特性 ①试验设计：温度、pH和栽培料含水量对病原菌生长特性的影响。活化待测菌株，用直径0.8 cm的无菌打孔器制备菌饼，接种于PSA平板中央，分别置于10、15、20、25、30、35 ℃培养4 d，十字交叉法测量各个温度处理下的菌落直径(mm)。配制pH值分别为5、6、7、8、9、10的PSA培养基，按照上述方法接种待测菌株，25 ℃条件下培养4 d，十字交叉法测量各个pH处理下的菌落直径，参照孙靖娥等[19]的方法计算菌丝生长速率。 将小麦烘干，按比例加水，浸泡20 h后，控干水分加入辅料，搅拌

均匀，用生石灰调节pH值至6.5，等量分装于20 mm×200 mm的试管中，配制成含水量分别为45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%的培养基质，灭菌后接种待测菌株菌饼，25 ℃条件下培养7 d，测量试管中菌丝生长前端至培养基质表面的距离，参照吴小平[20]的方法计算菌丝生长速度，以上每个处理均设置3个重复。②数据处理与分析：采用软件Microsoft Excel 2020和SPSS 18.0进行试验数据统计分析和作图。

2 结果与分析

2.1 病害症状、病原菌分离及致病性测定

发病初期，被侵染的蛹虫草栽培料表面长出白色菌丝，菌丝生长快速，5～7 d后，覆盖整个栽培料，蛹虫草菌丝体生长受到抑制，原基不发生或形成畸形子实体(图1A)。发病后期，病原菌沿已经形成的蛹虫草子实体基部向上蔓延，子实体表面覆盖白色绒毛状菌丝，导致子实体生长受阻(图1B)，栽培料侧面和底部呈现紫红色。

图1 蛹虫草病害症状Fig.1 Symptoms of infectedC.militarisA: 菌株CCBH-L侵染导致蛹虫草子实体畸形; B: 病原菌CCBH-L侵染蛹虫草子实体A: The malformed fruiting body of C. militaris induced by the infection of strain CCBH-L; B: The fruiting body of C. militaris covered by the mycelium of strain CCBH-L

从发病的样品中经分离纯化获得1株病原真菌，编号为CCBH-L。将菌株CCBH-L进行致病性测定，结果表明，接种病原菌菌丝块的蛹虫草栽培料均感染发病，对照组未发病，试验组接种病原菌3 d后，栽培料表面出现白色菌丝，第7天菌丝体长满整个培养料。随后，菌丝体蔓延至蛹虫草子实体基部，并沿着子实体向上生长，最终子实体上长满白色菌丝，发病症状与采集的样品一致。于发病样品中重新分离病原菌，经菌落形态和ITS序列分析，结果显示其与接种菌株CCBH-L一致。依据柯赫法则，确定菌株CCBH-L为病原菌。

2.2 病原菌形态学鉴定

菌株CCBH-L在PSA平板上培养，初期菌落呈白色，菌丝稀疏、棉絮状，后期产生色素，菌落中间及背面呈现紫红色(图2A)。在显微镜下未见大型分生孢子。小型分生孢子较多，串生、棍棒形、纺锤形，偶尔具有1～2个分隔，大小为(5.2～10.5) μm×(1.5～2.6) μm(图2B、C)。参考王拱辰和布斯的镰刀菌鉴定系统，菌株CCBH-L的培养及形态特征与镰刀菌属一致。

图2 菌株CCBH-L的形态特征Fig.2 Morphological characteristics of strain CCBH-LA: 菌落形态; B: 分生孢子; C: 串生的分生孢子A: Colony characteristics; B: Conidia; C: Conidia in clusters

2.3 病原菌的分子鉴定

菌株CCBH-L的ITS片段经扩增、测序及拼接后，获得长度为508 bp的碱基序列(GenBank 登录号：MW729732)。将该序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，结果显示其与轮枝样镰刀菌(Fusariumverticillioides) LS172(MN871568)的序列相似性为99.80%。选取并下载镰刀菌属典型种类的ITS序列，以灰绿曲霉(Aspergillusglaucus(Mich. ex L.: Fr.) Link)为外群构建系统发育树，进行系统发育分析(图3)。结果表明，菌株CCBH-L与F.verticillioides聚类在一个分支上，表现出较近的亲缘关系。结合上述形态特征及ITS序列系统发育分析结果，将菌株CCBH-L鉴定为F.verticillioides。

图3 基于ITS序列构建的CCBH-L菌株系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of CCBH-L and related strains

2.4 病原菌的生物学特性

不同温度处理下菌株CCBH-L的菌丝生长速率差异显著，在25～30 ℃范围内，菌株CCBH-L菌丝生长速率差异不显著，但显著高于其他处理组(P<0.05)，温度高于30 ℃或低于20 ℃，菌体呈现缓慢生长趋势(图4A)。当pH值达到6～8时，菌丝生长速率显著高于其他处理组(P<0.05)(图4B)。栽培料含水量对试验菌株的菌丝生长速率影响显著(P<0.05)，菌株CCBH-L在含水量为60%～75%的栽培料中，菌丝生长速度差异不显著，但显著高于其他处理组(P<0.05)。当含水量低于60%或高于75%时，菌丝生长明显变慢(图4C)。试验结果表明，该菌生长的适宜温度为25～30 ℃，适宜pH值为6～8，适宜含水量为60%～75%。

图4 温度(A)、pH(B)、栽培料含水量(C)对菌株CCBH-L菌丝生长速率的影响Fig.4 Effects of temperature(A)、pH(B) and water(C) content on strain CCBH-L growth rate图中不同小写字母表示不同处理之间在0.05水平存在差异显著(n=3)The different normal letters in the curves indicate significant difference among treatments at 0.05 level(n=3)

3 讨 论

蛹虫草生长发育的环境条件也适合病菌真菌的生长繁殖。因此，蛹虫草栽培生产的各个环节都可能发生真菌感染。病原真菌依靠气生菌丝旺盛生长和大量产孢侵染栽培料、蛹虫草菌丝和子实体，导致蛹虫草菌丝体生长受阻、不形成原基或子实体畸形[21-22]。蛹虫草生产中栽培料或菌丝体、子实体受真菌感染后，很难控制，通常是将带有病原菌的培养基质灭菌后直接丢弃，严重影响产量，并造成经济损失。分离蛹虫草栽培过程中的病原菌，明确其种类和生长特性，可为蛹虫草病害的有效防控提供参考。

本研究自被侵染的蛹虫草栽培料中分离到一株真菌菌株，结合形态学特征和ITS序列分析确定其为F.verticillioides，是F.verticillioides对人工栽培蛹虫草具有致病性的首次报道。镰刀菌分布广泛，抗逆性强，除了通过营养和空间竞争影响食用菌正常生长和发育外，还可产生多种胞外酶和镰刀菌毒素，破坏和抑制食用菌菌丝体和子实体生长，感染镰刀菌的食用菌子实体也会对消费者健康造成危害[23]。研究发现，轮枝样镰刀菌CCBH-L可同时对蛹虫草造成竞争性病害和侵染性病害，发病初期，培养温度低，轮枝样镰刀菌通过与蛹虫草菌丝争夺营养、水分和生长空间，影响菌丝体生长和原基分化。后期蛹虫草升温转色阶段，轮枝样镰刀菌生长速度变快，可发展为侵染性病害，菌丝体蔓延至已经形成的蛹虫草子实体上，导致子实体生长受阻。这一结果与刘晴等[7]研究一致，表明食用菌真菌竞争性病害和侵染性病害的界限并不固定。此前，贺宗毅等[10]报道了毛霉 (Mucormycosis)、黑根霉 (Rhizopusnigricans) 等对蛹虫草菌丝体生长的影响。张园园[24]报道了Gibberellaintermedia可以侵染蛹虫草菌丝和子实体，导致子实体倒伏，并最终无法正常生长。刘国丽等[25]报道了深绿木霉和扩展青霉对蛹虫草培养基质的侵染。刘晴等[7，26]报道了虫草生齿梗孢(Calcarisporiumcordycipiticola)、产扁虫菌素单端孢(Trichotheciumcrotocinigenum)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、淡紫拟青霉(Purpureocilliumlilacinum)、层出镰刀菌(F.proliferatum)、黄曲霉(Aspergillusflavus)和黑曲霉(Aspergillusniger)等13种蛹虫草病原真菌，并研究了虫草生齿梗孢菌株的生物学特性。这些研究为蛹虫草真菌病害的早期检测及预防提供了依据。

本研究发现，轮枝样镰刀菌CCBH-L菌丝生长的适宜温度为25～30 ℃，低于20 ℃生长速率显著下降，适宜含水量为60%～75%，pH值为6.0～8.0。蛹虫草人工栽培过程中，温度一般控制在15～22 ℃，适宜的栽培基质含水量为60%～65%，pH值一般为6.0～6.5。可见蛹虫草的栽培条件有利于菌株CCBH-L的生长。尤其是升温转色阶段，温度达到20 ℃以上更利于该病原真菌的生长，侵染容易发生。根据轮枝样镰刀菌CCBH-L的生长特性及病害发生特点，在蛹虫草栽培过程中，可通过将栽培室温度控制在20 ℃以下，抑制病原菌的生长，降低感染率。另外，接种区适当消毒，保持良好的卫生条件，及时清理带有病原菌的栽培料，灭菌后再丢弃，可有效防止该病菌的发生和扩散，降低生产损失。试验还将进一步研究蛹虫草真菌病害的防治方法，为蛹虫草栽培产业健康发展提供参考。