埃博拉病毒来源miRNA的研究综述

郑方亮， 王旌羽， 王 博， 杜亚兰， 朱春玉

(辽宁大学 生命科学学院，辽宁 沈阳 110036)

1 埃博拉病毒简述

埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)属于丝状病毒科，是一种有囊膜的单股负链非节段RNA病毒，病毒基因组约19 kb，编码7个基因，其基因组RNA被核蛋白所包裹，并与病毒聚合酶L、聚合酶辅因子VP35以及转录激活因子VP30共同组装形成病毒核糖核蛋白复合物(ribonucleoprotein，RNP)。RNP与病毒VP24相互作用，并被基质蛋白VP40围绕，病毒外层为囊膜，囊膜上镶嵌有结构性糖蛋白(glycoprotein，GP)，组成完整的病毒粒子[1]。

EBOV病毒粒子通过GP与多种细胞表面的附着因子相互作用[2]，经大胞饮进入细胞，在内体小泡中由宿主细胞来源的组织蛋白酶B(cathepsin B，CatB)和组织蛋白酶L(cathepsin L，CatL)切割GP形成GP1和GP2，GP1暴露其受体结合位点，与宿主Niemann-Pick C1 protein蛋白(NPC1)相结合[3]，GP2作为融合肽，促进病毒囊膜与宿主囊膜相互融合，使病毒RNP进入胞质，随后于胞质中完成病毒的转录、复制、翻译以及子代病毒的装配，最终以出芽的方式离开宿主细胞形成新的子代病毒。

黏膜和皮肤的伤口被认为是EBOV入侵机体的主要途径[4]。宿主的多种细胞均可被EBOV侵染，其中巨噬细胞与树突细胞是主要被侵染的细胞[5]，被侵染后，产生的多种细胞因子会募集其他免疫细胞[6]，为EBOV提供进一步复制的条件，同时，巨噬细胞及其他细胞被侵染后释放的大量细胞因子会引起细胞因子风暴[7]。随着病毒在淋巴系统中的扩散，包括血管、脑、肝、脾、肾脏、胃肠道、骨骼肌在内的多种组织器官均可被病毒侵染并逐渐丧失其功能[2]。感染最终造成埃博拉病毒病(Ebola virus disease，EVD)患者出现单核吞噬系统细胞受损、弥散性血管内凝血及多器官坏死，最终导致死亡[8]。

脑、眼、睾丸作为免疫特权部位，当EBOV打破相应屏障“定居”于此，便会出现持续性感染的现象[9]。在“康复”患者的脑脊液、房水中能够检测到EBOV的存在，说明这是造成感染者持续性脑膜炎、葡萄膜炎的原因[10]。部分男性幸存者在被感染40个月之后，精液中仍可以检测到EBOV，甚至在部分精液样本中可以分离到感染性EBOV。

2 病毒来源miRNA简述

miRNA是一类大小约22 nt的非编码RNA，在细胞中通过与Ago蛋白结合组装形成诱导沉默复合物(RNA-induced silencing，RISC)发挥广泛的基因表达调控作用[11]。经典的miRNA生成过程中，由宿主RNA聚合酶II/III转录生成pri-miRNA，在核酸酶Drosha作用下生成pre-miRNA，随后经exportin-5转运至胞质，被Dicer进一步加工成miRNA[12]。而在病毒miRNA生成过程中病毒并不完全依赖于经典miRNA生成机制，例如鼠γ疱疹病毒68产生一条tRNA-miRNA-encoded RNAs(TMERS)[13]，此RNA经RNase Z切割产生pre-miRNA，最终加工成为成熟miRNA。由于病毒miRNA生成机制上与经典miRNA生成有所差异，所以部分研究将其称为类miRNA的小RNA[14]。

2004年，第一个病毒来源miRNA被发现于EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)中[15]，此后，越来越多的病毒来源miRNA被相继发现，但迄今为止关于病毒来源miRNA的研究主要集中于DNA病毒中[16]，而对RNA病毒来源的miRNA研究相对较少，甚至对RNA病毒能否产生功能性miRNA尚存在争议[17-18]，包括：①部分RNA病毒在胞质中完成其生命活动，使得其失去了与位于细胞核中Drosha相互作用的机会；②RNA病毒基因组组成为RNA，若产生miRNA过程中核酸酶对病毒基因组切割，将会影响正常的病毒生命活动；③病毒来源miRNA产生后与部分病毒RNA序列反向互补，这是否会导致病毒生命活动受到抑制？直到2010年Andrew Varble等人通过对流感病毒进行改造[19]，将源于内源性神经元特异性microRNA-124(miR-124)的pri-miRNA序列插入NS基因组片段的NS1、NS2两个ORF之间，发现这种操作不但没有对病毒转录复制产生影响，而且所表达出来的miR-124具有正常功能，从而证明RNA病毒具有生成miRNA的能力。后续报道陆续指出登革热[20]、西尼罗河病毒[21]、SARS-CoV[22]、甲型流感病[23]及HIV[14]均具有产生类miRNA的小RNA的能力。

病毒miRNA的功能基本包括：①调控自身生命活动：默克尔细胞多瘤病毒(Merkel Cell Polyomavirus，MCV)产生的miR-M1通过靶向自身T-Ag转录本，或是被病毒自身产生的circMCV-T所吸附，从而调控自身的复制进程[24]。②调控宿主免疫：甲型流感病毒H5N1来源的类miRNA的小RNA(small RNA，sRNA)miR-HA-3P，具有靶向宿主免疫负调控因子poly(rC)-binding protein 2(PCBP2)的作用，该作用可造成更大量细胞因子的产生，引起宿主细胞因子风暴的产生，这可能是造成H5N1亚型病毒具有更高毒力的一个因素[23]。③调控宿主细胞存活与转化：卡波氏肉瘤疱疹病毒(Kaposi′s Sarcoma-Associated Herpesvirus，KSHV)来源的三条miRNA具有靶向宿主Caspase 3 的能力，当病毒来源miRNA敲降后发现细胞凋亡水平显著提高[25]。病毒在基因组结构和空间如此有限的条件下仍具有产生miRNA的能力，说明病毒来源miRNA经受住了进化的选择，对病毒生命活动有着重要影响[26]。

3 EBOV来源miRNA(EBOV-miRNA)的研究

2014年Liang等[27]首次对EBOV 来源的miRNA开展研究，发现在EBOV基因组中潜在有产生两个pre-miRNA和三个成熟miRNA的可能。他们对苏丹型EBOV基因组(Su dan ebolavirus strain Gulu，GenBank accession No. NC_006432)和扎伊尔型EBOV基因组(Zaire ebolavirus strain Mayinga-Volchkov，GenBank accession No. NC_002549)通过VMir analyzer program分析得到7条潜在的茎环结构。随后，使用MiPred algorithm基于pre-miRNA的结构特征确定出两条来源于EBOV基因组的pre-miRNA。这两条潜在的pre-miRNA保守存在于几株不同的扎伊尔型、苏丹型EBOV中。最后，使用MatureBayes tool 和Bayes-SVM-miRNA web server v1.0预测得到3条22 nt成熟miRNA EBOV-mir-1-5p、EBOV-mir-1-3p和EBOV-mir-2-3p。

为了证明三种miRNA真实存在的可能性，研究人员将两条预测得到的pre-miRNA克隆进pcDNA6.2-GW/EmGFP，转染HEK293T细胞，经RT-PCR可以检测到三条表达载体来源miRNA。Dicer敲降实验进一步证明此三条EBOV miRNA的生成依赖于Dicer通路。研究人员还在HEK293T细胞中使用双荧光素酶报告表达载体验证EBOV-miRNA的生物学作用，发现在HEK293T细胞中过表达EBOV-miRNA可以有效下调人工靶点基因的表达，从而证明预测得到的EBOV-miRNA可以在HEK293T细胞中有效发挥生物学作用。

2014年2月，扎伊尔型埃博拉病毒在西非几内亚出现[28]，随后蔓延至塞拉利昂、利比里亚、尼日利亚、马里等国家，此次埃博拉病毒的爆发，造成人类历史上最为严重的EVD传播，其传播范围、感染率、致死率创下历史新高。2015年Teng等[29]通过对2014年爆发中所有EBOV基因组进行多序列比对，使用VMir和MiPred分析得到EBOV-pre-miRNA-T1(136 nt)、EBOV-pre-miRNA-T2(80 nt)、EBOV-pre-miRNA-T3(99 nt)和EBOV-pre-miRNA-T4(99 nt)四条pre-miRNA，并通过MatureBayes tool对其预测，得到EBOV-miR-T1-5p、EBOV-miR-T1-3p、EBOV-miR-T2-5p、EBOV-miR-T2-3p、EBOV-miR-T3-5p、EBOV-miR-T3-3p和EBOV-miR-T4-3p 共7条成熟miRNA。

研究人员对成熟miRNA进行作用靶点分析，并结合GO分析构建靶调控网络，发现138条潜在靶基因，其中组蛋白脱乙酰酶5(Histone deacetylase 5，HDAC5)和JARID2(Jumonji，AT-rich interaction domain)是重要的转录调控因子，推测EBOV可能通过miRNA抑制宿主转录调控；NF-κB抑制因子(NF-κB inhibitor，NFKBIE)和受体相互作用蛋白激酶(Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1，RIPK1)是IL22和IFN-G的关键协同调控蛋白，推测EBOV通过miRNA干扰宿主的NF-κB通路。为了进一步验证其真实影响，研究人员将预测得到的miRNA模拟物转入Hela细胞，qRT-PCR检测发现miR-T1-5p、miR-T1-3p、miR-T3-5p和miR-T4-3p模拟物均造成NFKIBIE的显著下调，miR-T2-3p模拟物造成RIPIK1和JARID2的下调，miR-T3-5p模拟物造成HDAC5的上调，而所有miRNA模拟物均可造成RIPK1的下调。这一系列实验结果表明，EBOV可通过自身编码的miRNA调节宿主基因的表达进而影响宿主细胞的正常代谢和免疫应答。

基于相似的实验思路，Liu等[30]用不同的预测软件(预测流程：miRNAFold→MiPred/miRD→MatureBayes)对Zaire ebolavirus基因组(GenBank: KM519951.1)进行预测，发现EBOV基因组中VP30与VP24之间的序列(基因组定位9 869～9 966 nt)具有产生pre-miRNA的能力，可产生两条成熟miRNA，分别命名为Zebov-miR-1-5p和Zebov-miR-1-3p。通过对2014年EBOV感染病人血样转录组数据(RNA-Seq)分析，发现在预测序列基因组定位附近确实出现了reads富集，从而初步证实了预测结果的准确性。为了进一步研究其生物学功能，研究人员利用TargetScan筛选种子区序列，鉴定EBOV miRNAs的基因靶点，发现Zebov-miR-1-5p与人源miRNA hsa-miR-155-5p的功能高度相似，推测其具有抑制宿主细胞中核转运蛋白importin-α5表达的能力。鉴于importin-α5蛋白在核蛋白转运入核、病毒的胞内转运、细胞凋亡调控及DNA重组等过程中发挥作用，推测EBOV所产生的Zebov-miR-1-5p是决定病毒毒力的一个关键因子。

EVD幸存者所遭受的葡萄膜炎和致盲性眼内炎症，提示EBOV侵染免疫特权部位之后产生的持续性感染现象对抗病毒治疗具有重要意义[31]。因此，Oliver等[32]对扎伊尔型EBOV侵染的视网膜色素上皮细胞中miRNA表达变化进行了检测，发现在视网膜色素上皮细胞中有13个宿主miRNA高度上调，2个宿主miRNA被严重抑制。同时也发现Liu等[30]预测得到的miR-1-5p在被侵染的视网膜色素上皮细胞中具有较高的表达量，而其他11种前人预测得到的miRNA reads数量极低，几乎可以忽略不计。

早期研究虽然利用生物信息学手段发现了EBOV-miRNA的存在，并经过合成、转染实验验证了这些预测出的miRNA存在的可能，然而这些miRNA是否在病毒感染过程中真实存在一直没有得到确认。直至2016年Chen等[33]的研究才终于证实了EBOV来源的miRNA在感染病人体内的存在。Chen等的研究同样对Zaire EBOV(NC002549)基因组潜在的miRNA进行预测，发现在EBOV基因组中VP40、NP以及L基因序列中具有形成pre-miR-VP、pre-miR-NP 以及pre-miR-L的能力，预测所得成熟miRNA均来自于前体miRNA的3′臂，分别为miR-VP-3p、miR-NP-3p、miR-L-3p。对三条前体miRNA进行保守性分析指出，仅有pre-miR-VP高度保守，可在2014年爆发的EBOV各毒株中预测到。随后，研究人员从EBOV患者血样中分离外泌体并提取RNA，经Northern blotting检测发现EVD患者血清中确实有miR-VP-3p存在，其含量可以达到100 fmol/L，通过对EVD患者血清中病毒来源miRNA进行测序，其序列组成与预测所得miR-VP-3p碱基组成一致。在对27名EVD患者以及13名健康志愿者血清进行qRT-PCR检测发现，qRT-PCR在检测miR-VP-3p过程中高度灵敏，在EVD患者中，EBOV阳性血样中miR-VP-3p的浓度平均为205.3 fmol/L，并且在EVD患者处于急性期时，血清中miR-VP-3p以高水平存在，在疾病恢复期间miR-VP-3p消失。后续的实验证实，在EVD患者血清尚未表现出EBOV阳性之前，即可检测到miR-VP-3p的存在。Chen等对该现象做出的解释是：EBOV在宿主细胞进行复制的过程中，由于某些未知的机制，VP40来源的miR-VP-3p会被装入宿主外泌体中，在病毒尚未裂解细胞释放子代病毒之前，外泌体已先释放出来。该研究不但确定了EBOV-miRNA在病毒感染过程中真实存在，而且发现其存在于外泌体中，BLAST分析还证实miR-VP-3p仅由EBOV产生，在人类基因组序列以及其他病毒基因组序列中均不存在，因此提出，该miRNA可以作为一种EVD患者早期诊断的生物标记。

为了验证前人所预测miRNA的准确性和真实性，Duy等[34]对前人预测得到的12条miRNA进行了进一步分析和试验检测。分析发现所有前期预测的miRNA中，除miR-VP-3p以外，其他均来源于EBOV正链RNA。Liang等[27]预测所得的三条成熟miRNA中，EBOV-miR-1-3p (Liang)、EBOV-miR-1-5p (Liang)仅能比对到苏丹型EBOV中，这与Liang等[27]文章提及的“在几株不同的扎伊尔型、苏丹型EBOV中保守”产生冲突。因此研究人员针对除EBOV-miR-1-3p (Liang)和EBOV-miR-1-5p (Liang)外的其余10条EBOV-miRNA，采用锁核酸引物通过qRT-PCR分析了不同的EBOV毒株(EBOV/Mayinga-MA，EBOV/Kikwit，and EBOV/Makona)侵染不同动物模型(小鼠、恒河猴、食蟹猴)后EBOV-miRNAs的表达量，同时对2014年塞拉利昂EVD患者血浆和血清样本中EBOV miRNAs的表达量进行分析。先期预测所得的10条成熟miRNA，虽在不同实验样本中表达量不尽相同，但是四种不同EBOV毒株侵染后，这10条不同的EBOV-miRNA均能有效检测到，其中miR-1-5p是所有感染模型中表达量最高的miRNA，其次是miR-T3-3p和miR-1-3p。

在小鼠侵染组中，通过每日对小鼠血样进行检测发现，在侵染后第2天小鼠未表现出临床症状之前即可检测到四种EBOV-miRNA。随侵染时间的延长，EBOV-miRNA的表达量逐渐与EBOV病毒载量相当。人类患者样本中，在病毒载量处于较低水平时，EBOV-miRNAs的表达量高于样本中病毒载量，这进一步说明EBOV来源的miRNA可以在实践中作为EVD快速诊断的生物标记。

在证明了真实存在的基础上，研究人员对这10条成熟的EBOV-miRNAs进行了靶基因预测，结果发现小鼠、恒河猴、人类中被EBOV-miRNAs靶向的基因在这三种不同物种之间具有保守性。表达量较高的miR-1-5p、miR-T2-3p和miR-VP-3p预测所得的基因靶点最多。这些靶点涉及众多细胞通路，这进一步说明EBOV-miRNAs在病毒感染过程中起到了不可或缺的作用。

虽然通过RT-PCR手段检测到了所预测的miRNA序列的存在，但是这些检测到的序列真的能以miRNA的结构在细胞内存在吗？它们真的能行使miRNA的功能吗？判断一段序列是否真的以miRNA的结构存在并行使其功能，很重要的一个方法就是看其是否能与Ago蛋白结合组成RISC，针对这一点，Prasad等[35]开展了进一步研究，而且他们的研究对象不只是miRNA，而是包括miRNA在内的小非编码RNA(small ncRNA，sncRNA)。研究人员用EBOV侵染人肝癌来源细胞系(HepG2)、RO6E/J (来源于北非果蝠Rousettusaegyptiacus胚胎组织)、EpoNi/22.1 (来源于加纳饰肩果蝠Epomopsbuettikoferi成年动物肾脏)，然后对19～32 nt sncRNA进行了富集和测序分析。结果发现，绝大多数的病毒sncRNA来源于病毒基因VP40、GP、VP30、VP24及L的转录起始点(transcription start sites (TSS))。而且，在多种不同的侵染处理组中，这些病毒来源的RNA具有尺寸相似性及尺寸范围的一致性，说明检测到的这些RNA并非是病毒与宿主对抗过程中随机产生的降解产物，而是在侵染中稳定存在的产物。这些EBOV-sncRNA源自于病毒正链RNA，且病毒mRNAs与sncRNAs呈现良好的线性关系，由此推测sncRNA来源于病毒mRNA，而非cRNA复制中间体。接下来，研究人员通过Ago蛋白的免疫沉淀结合qRT-PCR对EBOV侵染后的sncRNA进行分析，在6次独立的实验重复中，有2次富集到EBOV GP基因来源sncRNA，1次富集到了 L 基因来源sncRNA，而在每次实验中，宿主miRNA均能被有效检测到。因此认为病毒产生的sncRNA与Ago蛋白之间是一种瞬时的非特异性作用。为了探究sncRNA的产生机制，研究人员使用Dicer敲除的宿主细胞进行检测，发现EBOV来源的sncRNAs是以非Dicer依赖性的机制产生。使用Ago2敲降的宿主细胞也未发现对sncRNAs表达量产生影响，但CPSF3L敲降组对GP基因来源的sncRNAs产生中等抑制。然而，荧光素酶试验未发现EBOV-ncRNAs起到转录本沉默的作用。

综合以上实验结论不难发现，相较于标准miRNA来说，在EBOV中发现的sncRNAs，其生成不依赖于宿主Dicer或Drosha，未被证实与Ago蛋白结合，也未表现出对宿主基因转录的调节作用，因此不能将EBOV来源sncRNA称为miRNA或siRNA，也许它们是以一种未知的机制产生并作用于病毒的生命活动。

4 展 望

EBOV的研究一直受制于有效的实验动物模型[36]和安全的实验环境等因素[9]。非人灵长类动物作为EBOV研究的良好实验对象，其获取与饲养的高成本使众多科研工作者望而却步。EBOV作为一种高致死性的病毒，其研究高度依赖生物安全4级实验室及经过严格训练的实验人员，这对于EBOV的研究也是个巨大阻碍。因此，对EBOV的研究和认识还非常欠缺。

得益于生物信息学和测序技术的进步，研究人员能够通过分析方法探究EBOV-miRNA的存在及功能[37]。然而，就技术而言，虽然各种预测软件算法越来越精准，分析越来越精细，但在实际细胞内复杂的环境下，这些预测到的满足miRNA生成原则的RNA序列是否真的会在与细胞内各种分子相互作用的条件下形成成熟的miRNA？即便能够形成，能否在复杂的细胞内环境中发挥其预测的功能，这都是生物信息学手段所不能证实的。另一方面，miRNA发挥其生物学功能必然与其化学计量相关[38]，而大多数研究往往利用表达载体过表达miRNA来检验其功能，这种非真实剂量miRNA所表现出的功能是否与真实感染过程所发挥的功能一致也是很难证明的[39]。而Prasad等[35]的研究更是给EBOV所产生的sncRNA中是否真的存在传统意义的miRNA画了大大的问号。在作者看来，随着人们对miRNA研究的广泛开展，越来越多miRNA在各种高等、低等甚至RNA病毒中被人们发现，miRNA在生物体生命活动中存在的普遍性和重要作用也已得到认可，因此拥有19 kb RNA基因组的埃博拉病毒完全有可能产生miRNA在病毒的感染过程中发挥作用。随着测序技术和生物信息学手段的进步及对miRNA认识的进一步深入，以及更多针对埃博拉病毒miRNA研究工作的积累，EBOV-miRNA是否真实存在及其生物学功能将逐渐明晰。