一株耐高温产纤维素酶芽胞杆菌的筛选鉴定及其液体发酵条件优化

郭玲玲， 江志阳， 陶姝宇， 田佳美, 王洪奇， 张 晶

(1.辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000；2.中国科学院 沈阳应用生态研究所，辽宁 沈阳 110016；3.辽宁省农业发展服务中心, 辽宁 沈阳 110032；4.辽宁土木启生物科技有限公司，辽宁 沈阳 110016；5.辽宁省现代农业生产基地建设工程中心,辽宁 沈阳 110033)

随着蔬菜种苗产业的集约化、规模化、专业化发展，育苗基质的用量不断增加。目前用于育苗的基质大多是以草炭为主要原料的复合基质，然而草炭为不可再生资源，储量有限，大量开采会破坏生态环境[1]。因此，寻找可以替代草炭进行育苗的基质材料已成为热点研究方向。我国农业废弃物数量巨大，大部分废弃物被丢弃、掩埋或者焚烧，不仅造成资源浪费，且对生态环境造成污染[2]。已有研究表明，菌糠[3]、秸秆[4]、菇渣、椰糠等农业废弃物发酵后可用于生产基质，在蔬菜育苗及栽培中取得了良好的效果[5-7]，不仅可以解决环境污染和资源浪费的问题，还可以为育苗基质提供充足、廉价、优质的原材料。近年来，利用菌糠、秸秆作为育苗基质材料的研究较多。我国的菌糠、秸秆资源丰富，每年约产生1.5万t食用菌菌渣、2.6亿t玉米秸秆。菌糠含有大量的粗纤维、木质素、多糖以及丰富的蛋白质、氨基酸、碳水化合物、维生素和微量元素[8]。此外，菌渣因其疏松多孔的结构、丰富的营养成分[9-10]，被认为是一种良好的替代草炭的理想有机基质[11-13]。王晓娥等[14]通过研究番茄幼苗的生长发育情况筛选出适宜的秸秆与菌渣混合栽培基质。杜彦梅等[15]将腐熟的黑木耳菌渣结合蛭石、有机肥配制栽培基质，发现菌渣含量在70%和80%的处理辣椒幼苗生长势显著高于对照。玉米秸秆因含有丰富的钾、钙、镁、硫等矿质元素，是制备植物栽培基质的良好原料[16]。国外将玉米秸秆作为栽培基质种植蔬菜的方式已得到广泛应用[17]，而国内当前腐熟秸秆的主要利用方式为与草炭、炉渣、菌渣等混合作为栽培基质，开展蔬菜有机生态型无土栽培，该技术具有本土化、成本低、可再生和环保的特点[18-20]。为了保障农业废弃物能够形成稳定、无害的育苗基质，通常原料要经过充分生物氧化和腐熟的高温好氧堆肥处理。但由于菌糠和秸秆中纤维素、木质素含量高，结构复杂，不易降解，在一定程度上制约着堆肥的周期和效果。这就需要在微生物作用下，将木质素、纤维素、半纤维素以及粗蛋白分解为简单的无机物、小分子有机物和腐殖质等[21]，易于作物吸收利用[22-23]。此类微生物中纤维素酶菌研究较为普遍，但是目前国内外关于此类纤维素降解菌的报道最适温度大多在40 ℃以下,陶治东等[24]在香菇菌渣中筛选的纤维素降解菌最适温度为30 ℃。景如贤等[25]分离出一株芽胞杆菌，当培养条件温度为 37 ℃时该菌株的 CMC 酶活最高。诸葛容夏[26]分离出一株游动球菌属Planomicrobiumsp. WH2-56，在 37 ℃条件下该菌株具有最大的 FPA 酶活和 CMC 酶活。钟斌等[27]从沼渣自然堆肥中分离出一株高效的纤维素降解细菌，在温度、pH、培养时间和接种量分别为 35 ℃、7.0、3 d和 2% 时，能够得到最高的 CMC酶活和滤纸酶活。此类菌株很难适应好氧堆肥过程必须经历的高温(≥50 ℃)环境。目前，从畜禽粪便堆肥过程中筛选耐高温产纤维素酶菌的研究较多，关于以菌糠和秸秆为主要原料筛选此类菌株的研究鲜见报道。为此，本研究以育苗基质中农业生物质废弃物菌糠和秸秆为原料，分离筛选一株耐高温纤维素酶菌株E，鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)，并进行了菌株E生长特性研究及产酶培养条件优化，以期为生产优质育苗基质奠定良好基础，为实现农业废弃物的循环利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品 试验育苗基质(草炭、菌糠、秸秆、牛粪为主要成分)来源于辽宁土木启生物科技有限公司。

1.1.2 培养基 ①好热性纤维素分解菌液体培养基(筛选纤维素酶产生菌)：Na2HPO41 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，蛋白胨0.5 g，KH2PO40.5 g，K2HPO40.5 g，CaCO30.5 g，MnSO4(1%)和FeSO4(1%)各加一滴，水1 000 mL，pH值 7.0；②纤维素刚果红培养基(微晶纤维素培养基)：K2HPO40.5 g，微晶纤维素1.88 g，MgSO40.25 g，明胶2.0 g，刚果红0.2 g，琼脂14.0 g，蒸馏水1 000 mL；③NA培养基(分离及保存)：牛肉膏 0.3%，蛋白胨 1%，NaCl 0．5%，pH值7.0～7.2；④优化培养基：液体发酵培养基采用100 mL培养基中含有麸皮1.0 g，豆粉0.5 g，NaCl 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，KH2PO40.05 g，K2HPO40.05 g，CaCO30.5 g，MnSO4和FeSO4各加2.5 mg，pH值6.0。

1.2 方法

1.2.1 菌种富集、分离方法 ①材料处理：将供试样品材料1 g投放到99 mL无菌水中处理30 min，滤纸过滤，以滤液作为分离样品液。②富集培养：在好热性纤维素分解菌液体培养基5 mL中加入长6 cm、宽1 cm的滤纸条，121 ℃灭菌30 min。取1 mL样品液加入到上述培养液中，55～60 ℃培养72 h。③菌种分离：取富集培养液进行梯度稀释，在NA培养基中涂平板，55～60 ℃培养72 h，从中挑选形态不同的单菌落，利用平板划线法将其纯化后，保存到NA斜面。④筛选：根据产纤维素酶的微生物可以利用纤维素为唯一的碳源生长，以微晶纤维素和CMC为唯一的碳源，对每个菌株进行点接种，筛选可以产生纤维素酶的菌株，根据水解圈的大小，选用产生水解圈大的为优选菌种。

1.2.2 菌株纤维素降解能力测定 产纤维素酶定量检测[28-29]：取1 mL离心上清液加入1 mL柠檬酸钠缓冲液和1条6 cm×1 cm的滤纸条作为底物，50 ℃恒温水浴60 min后加入3 mL的DNS终止反应，并煮沸3 min，在540 nm下测定吸光度。用离心上清液加柠檬酸缓冲液作空白，以葡萄糖溶液作标准曲线比色读数换算出每1 mL发酵液作用1 h所产生的葡萄糖的量。FPase国际单位等于酶液水解反应中每1 min由滤纸生成1.0 μmol葡萄糖的酶量以IU/mL来表示。酶活力定义:在上述反应条件下,纤维素酶液每分钟催化底物1% CMC-Na溶液生成1 μg葡萄糖所需酶量定义为一个酶活力单位(U)。

1.2.3 菌株分类鉴定 ①形态学观察：将产纤维素酶菌株在NA培养基上划线，28 ℃下培养48 h，观察记录菌落形态、颜色及透明度等特征，并在光学显微镜下观察细菌形态。②生理生化鉴定：对菌种进行明胶液化、产色素、淀粉水解、还原硝酸盐、固氮能力等试验测试。形态学特征和生理生化试验 根据《伯杰细菌鉴定手册》(第8版)和《常见细菌系统鉴定手册》[30-31]，对分离得到的菌株进行鉴定。③分子生物学鉴定：采用 DNA 提取试剂盒提取菌株的 DNA，琼脂糖凝胶电泳法分析 DNA 的纯度。以菌株E基因组为模板，扩增引物选取16S rDNA扩增的通用引物进行PCR扩增，PCR 反应体系(25 μL)： 2×SanTaqPCR Mix 12.5 μL，27F (25 μmol/L) 1 μL，1492R (50 μmol/L) 1 μL，DNA 模板(10 mmol/L) 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循环 35 次；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。扩增及测序工作均由宝生物工程有限公司完成。将测得的序列在NCBI(https://www. ncbi. nlm. nih. gov/)数据库中进行BLAST序列比对，并与已报道细菌菌株的16S rDNA序列进行同源性比较，并利用MEGA X的Neighbor-joining法(自展数为1 000)构建并分析菌株系统发育进化树。

1.2.4 液态发酵条件的优化 基础培养条件：以优化后的液体培养基培养菌株，装液量100 mL(500 mL三角瓶)、培养温度55 ℃、接种量2%(体积分数，下同)、初始pH值7.0、培养时间48 h，其他条件不变的情况下，分别对装液量、培养温度、接种量、初始pH值、培养时间进行调整，测试其对发酵液中酶活力影响。①最佳发酵时间的确定：在基础培养条件下，分别在12、24、36、48、60、72 h取样，每次取3个样品，测试发酵酶活力和菌数。②培养温度对菌株产酶活力的影响:在基础培养条件下，将培养温度设置为40、45、50、55、60 ℃，其他不变，每个处理3次重复，测试48 h发酵液的纤维素酶活力。③培养基的初始pH值对菌株产酶活力的影响：在基础培养条件下，将培养基初始pH值分别调为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，其他不变，50 ℃培养，每个处理3次重复，测试48 h发酵液纤维素酶活。④装液量对菌株产酶活性的影响：在基础培养条件下，将装液量分别设定为50、100、150、200 mL，其他不变，每个处理3次重复，48 h后测试不同处理纤维素酶活力。⑤接种量和菌龄对产酶活性的影响：在基础培养条件下，以培养12、15、18 h的种子液分别按照0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的量接种，其他条件不变，每个处理3次重复，48 h后测定不同菌龄和不同接种量发酵液维素酶酶活力。

2 结果与分析

2.1 纤维素分解菌株的分离和优选

从样品富集培养液中分离纯化获得20株菌，保存到NA斜面上备用。经过初筛得到其中的6株菌有较好地效果(见表1)。根据羧甲基纤维素钠和刚果红-纤维素平板上的生长结果，由表1可以看出菌株E的降解纤维素能力最强，可作为优选菌株。

2.2 菌株E的鉴定

2.2.1 菌株的形态特征和生理生化特征 ①菌株的形态学特征：菌株E在NA固体培养基上菌落白色、圆形，表面较黏稠，多褶皱，边缘不规则，中心区有不规则脊状物，其上由放射状沟纹分隔开，培养24 h时菌落大小为0.3～0.7 cm，有暗褐色的水溶性色素。老培养物为近圆形的厚垣孢子和近球形孢囊，见图1。②菌株的生理生化特性：生理生化鉴定结果显示，菌株E能形成菌膜；能够使明胶液化，无色素；能使淀粉水解；能够还原硝酸盐；具有固氮能力；能利用蔗糖和甘露糖；接触酶、脲酶和MR反应试验阴性；VP试验结果阳性。

图1 菌株E的菌落形态Fig.1 Colony morphology of strain E

2.2.2 菌株E 16S rDNA序列测定分析与系统发育进化树构建 使用 NCBI 网站对菌株E的 16S rDNA 序列与数据库中其他菌株的16S rDNA 序列进行比对。登陆 NCBI 网站(美国国立生物技术中心网站)，使用 BLAST 在线将得到的16S rDNA 序列，进行 BLAST 在线分析。将测出的序列通过 16S rDNA 序列同源性比较，菌株E与枯草芽胞杆菌的16S rDNA 序列同源性达到99%。从 GenBank 中选择序列相似菌株，应用 Bioedit 7.0 和 Mega 软件进行多重比较后构建系统发育树(图3)，根据同源性比较结果及系统发育分析，结合菌落形态学特征及生理生化特征鉴定本菌株E为枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)。

图2 菌株E的16S rDNA 系统发育进化树Fig.2 16S rDNA phylogenetic tree of strain E

图3 菌株E发酵过程的分析Fig.3 Fermentation process analysis of strain E

2.3 枯草芽胞杆菌E生长特征及发酵条件优化

2.3.1 温度对菌株E生长影响 菌株E的生长温度范围较广，在常温和高温下均可生长。由表2可知，菌株E的最低生长温度为20 ℃，最高生长温度60 ℃，最适生长温度50 ℃。温度较低时菌丝形成量较多，菌丝断裂较慢，而在温度较高条件下，菌丝很快分化成为大小不同的小杆菌和球菌，但培养基的湿度较大时菌丝形成量较多。

表2 不同温度下E菌株的生长情况Table 2 Growth of strain E at different temperatures

2.3.2 枯草芽胞杆菌E发酵条件优化 ①发酵时间对菌株产酶活性及菌数的影响：由表3可知，菌株E接种于优化的培养基上培养72 h，发酵过程中酶活力和OD值在相互影响中变化。在24 h内菌体生长较快，24 h后生长趋于平缓。48 h后OD值开始下降，而24 h后发酵液的酶活性开始迅速升高，即OD值很低时酶活力同样很低，在菌体增长速度变慢时，酶活性才开始迅速上升，但两者不是同时达到最大值，而是在48 h时OD值开始下降，酶活力才达到最大值，3 d后酶活力不再增加。酶的产生和OD值的提高相比较具有滞后性。所以发酵时间应该选在菌株生长的稳定期末，衰亡期之初，从本研究分析，菌株E的最佳发酵时间为48 h。②菌株E最适发酵温度的确定：为了解菌株E的最适产酶温度，把菌株E接种到优化培养基中，由图4可知，40～60 ℃是菌株E可以正常生长的温度范围，40 ℃以下菌株生长不良，65 ℃时菌株只能存活，不能繁殖、代谢。50 ℃培养条件下的产酶活力最佳，纤维素酶活力达到1.00 IU。55和60 ℃的温度下虽然菌株生长旺盛，OD值保持较高，但酶活力下降40%，因此，菌株E的发酵最佳温度为50 ℃。③初始pH对菌株E发酵产酶的影响：调节发酵培养基的初始pH值为 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5，由图5可知，接近中性的pH有利于菌株E产纤维素酶，在初始pH值为6.0培养时产生的酶活力最高，pH值增加到7.5时，酶活力大大降低。因此，要获得最高的产纤维素酶酶活力，菌株E培养基的初始pH值应调节到6.0。④装液量对菌株E产纤维素酶活力的影响：在500 mL的三角瓶中分别装入50、100、 150和200 mL发酵培养基，50 ℃下培养48 h后测定纤维素酶活力。菌株E是兼性厌氧菌，不同的装液量影响到发酵的通气量。由图6可知，装液量影响菌株E的产酶效率，装液量过多不能满足对氧气的需求，而装液量少，则酶活力相对比较高，但和100 mL的装液量相比要低一些，最适合的装液量是100 mL。⑤最佳接种量、菌龄对菌株E纤维素酶活力的影响：从菌株E在液体培养基中的生长曲线可以看出，菌株在12～20 h之间均处于对数生长期，可以作为种子液来接种，但是否在12～20 h之间有一个最好的时间，需要进一步研究。试验将菌龄为12、15、18 h的种子分别按照0.5%～5%的量接种到发酵培养基中。50 ℃培养48 h，测定酶活力。

表3 发酵过程的各项指标变化情况Table 3 Changes of various indicators during the fermentation process

图4 温度对E菌体产酶和生长量的影响Fig.4 Influence of temperature on enzyme production and growth amount of thalamus E

图5 培养基初始pH对产酶的影响

图6 不同装液量对产酶的影响Fig.6 Influence of different liquid filling volumeon enzyme production

由图7可知，菌龄对发酵液酶活力影响大，培养18 h的种子液接种发酵所得的发酵液酶活力最高，发酵效果最好，在接种量为1%～5%的情况下酶活力均高于1.00 IU，而培养12和15 h的种子液接种发酵所得的发酵液酶活力均小于1.00 IU。其原因可能是由于对数生长期是菌株生长繁殖最快时期，同时菌株自身的生长最快，代谢最旺盛，生物活性也在不断地增强；接种量对发酵液中酶活性影响小，接种量在2%～5%之间差异不大。低于2%时，发酵液酶活略低，因此，最适接种量应为2%～5%之间。

图7 不同菌龄和接种量对产酶的影响Fig.7 Effects of different cell age and inoculation volume on enzyme production

3 讨 论

菌株E经鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)，枯草芽胞杆菌是微生态制剂的常用菌种之一，因其具有较高的蛋白酶和纤维素酶活性、较强的生物夺氧能力、耐高温高压、易贮存等特点而被广泛应用[32]。本研究以育苗基质为原料，分离出6株分解纤维素的高温菌株，筛选并鉴定出1株枯草芽胞杆菌菌株E，所获菌株最适生长温度为50 ℃，液体发酵过程中培养基初始pH值6.0，最适装液量100 mL，18 h菌龄的种子液、接种量2%～5%条件下进行液体发酵48 h，具有最优的菌株活性和产纤维素酶活力。

在芽胞杆菌的生长和繁殖过程中，发酵时间、培养温度、初始pH值是影响其生长和代谢的重要因素，而培养过程中装液量、接种量和菌龄也是影响发酵结果的关键因素。本研究以这6种对纤维素酶活力影响较大的单因素进行试验，所获菌株E最适生长温度为50 ℃，在堆肥过程中积温温度较高情况下仍可以保持较好的纤维素酶活力，这与常慧萍等[33]、王海峰等[34]、易旻等[35]报道的某些芽胞杆菌属菌株具有高温降解纤维素的结果一致，说明这类菌具有高温降解纤维素功能，能在堆肥过程中更好地促进物料腐熟。同时还发现，菌株E最佳发酵时间为48 h，相比较特基拉芽胞杆菌在第 8天达到最大酶活[36]，鲍氏不动杆菌在第 5天达到最大酶活[37]，里氏木霉在第 4天达到最大酶活[38],菌株E的发酵周期明显更短，在工业实际应用中，将大大节约时间成本，提高生产效率。可见，本研究为后续研制新型优质育苗基质活性生物菌剂、生产高温纤维素酶提供了菌种资源及科学依据，为寻找解决泥炭资源枯竭和农业废弃物资源化利用的有效途径提供参考。