产羟基喹啉基乙酮芽胞杆菌的筛选与分析

陈峥 刘波

摘 要：芽胞杆菌是一类重要的生防微生物，能产生多样的抗菌物质。为了挖掘产喹啉类抑菌物质的菌株资源，以56个芽胞杆菌菌株为试验材料，运用液相色谱四级杆飞行时间质谱（LC-QTOF-MS）技术对其发酵产物进行检测，对质谱数据进行分子特征提取和Metlin谱库比对。结果表明：筛选获得6株产羟基喹啉基乙酮（Quinacetol）的芽胞杆菌，分别是土壤芽胞杆菌FJAT14232（Bacillus soli）、枯草芽胞杆菌FJAT8784（Bacillus subtilis）、波茨坦短芽胞杆菌FJAT10006（Brevibacillus borstelensis）、浸麻类芽胞杆菌FJAT14204（Paenibacillus macerans）、嗜碱芽胞杆菌FJAT0014（Bacillus alcalophilus）和米氏解硫胺素芽胞杆菌FJAT14205（Aneurinibacillus migulanus）。6株芽胞杆菌中的羟基喹啉基乙酮占各自总代谢物的相对含量均高于1.17%，且与Metlin谱库匹配得分均大于95.35。其中，土壤芽胞杆菌FJAT14232（Bacillus soli）中的羥基喹啉基乙酮相对含量最高，占其总代谢物相对含量的1.68%。嗜碱芽胞杆菌FJAT10014（Bacillus alcalophilus）的谱库检索得分最高，为99.13。本研究为微生物来源的喹啉类抑菌剂的开发与利用提供菌种资源和数据支持。

关键词：羟基喹啉基乙酮;喹啉类;芽胞杆菌;抗菌化合物;液相色谱四级杆飞行时间质谱

中图分类号：S 476.1   文献标志码：A   文章编号：0253-2301（2021）04-0009-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.04.002

Screening and Analysis of Bacillus Producing Quinacetol

CHEN Zheng， Liu Bo*

（Institute of Agricultural Biological Resources， Fujian Academy ofAgricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： Bacillus is an important biocontrol microorganism which can produce a variety of antimicrobial substances. In order to mine the strain resources producing the antibacterial substance quinolines， a total of 56 Bacillus strains were used as the experimental materials and their fermentation products were detected by the liquid chromatography-quadrupole time of flight-mass spectrometry （LC-QTOF-MS）， and the molecular characteristics were extracted from the mass spectrometric data and compared with the Metlin library. The results showed that， 6 strains of Bacillus producing quinacetol were screened and obtained， including Bacillus soli FJAT14232， Bacillus subtilis FJAT8784， Brevibacillus borstelensis FJAT10006， Paenibacillus macerans FJAT14204， Bacillus alcalophilus FJAT10014， Aneurinibacillus migulanus FJAT14205. The relative contents of quinacetol in the total metabolites of the six Bacillus strains were all higher than 1.17%， and the matching scores with Metlin library were all greater than 95.35. Among them， the relative content of quinacetol in Bacillus soli FJAT14232 was the highest， accounting for 1.68% of the relative content of its total metabolite， and Bacillus alcalophilus FJAT10014 had the highest score of 99.13 by library searching. This study could provide the strain resources and data support for the development and utilization of the quinoline bacteriostatic agent from microorganisms.

Key words： Quinacetol; Quinolines; Bacillus; Antimicrobial compound; Liquid chromatography-quadrupole time of flight-mass spectrometry

羟基喹啉基乙酮（Quinacetol），又名5乙酰基8羟基喹啉、1（8羟基5喹啉）乙酮，CAS号为2598314，分子式是C11H9NO2，精确分子量为187.0630。羟基喹啉基乙酮具杀真菌活性，广泛应用于杀菌剂中。羟基喹啉基乙酮的化学结构特征是含有喹啉（C9H7N）骨架，属于喹啉类化合物。喹啉类化合物是含氮杂环中一类非常重要化合物，具有多种优良的药理作用和生物活性，应用于医药和农业的多个领域[1-2]。在医药行业中，喹啉类化合物用于疟疾、溃疡、癌症、HIV病毒和精神分裂等疾病的预防与治疗

[3]。由于喹啉类化合物具有高效的杀菌[4-5]、杀虫[5]和除草[3]作用，被开发用作农药产品。同时，喹啉类化合物是农药合成的重要方向，用作构建新型结构和先导化合物[6-7]，开发高效、低毒的喹啉类农药[8-9]。

目前，喹啉类化合物的来源主要通过人工化学合成[10-13]，而从微生物次级代谢产物中获得喹啉类化合物的报道较少，如白浅灰链霉菌Streptomyces albogriseolus[2，14]，然而芽胞杆菌产羟基喹啉基乙酮还未见报道。芽胞杆菌是一类重要的功能微生物[15]，具有拮抗多种微生物的特性。为了挖掘产喹啉类化合物的微生物资源，应用液相色谱四级杆飞行时间质谱（LCQTOFMS）技术，筛选到能产羟基喹啉基乙酮的芽胞杆菌，为芽胞杆菌来源的喹啉类抑菌剂的开发与利用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 芽胞杆菌菌株56株（表1），包括土壤芽胞杆菌FJAT14232（Bacillus soli）、枯草芽胞杆菌FJAT8784（Bacillus subtilis）、波茨坦短芽胞杆菌FJAT10006（Brevibacillus borstelensis）等，供试菌株于-80℃甘油保存。

1.1.2 试验试剂 甲醇（色谱纯，美国JT Baker公司），乙酸铵（色谱纯，上海安谱科学仪器有限公司），胰酪大豆胨液体培养基（美国BD公司），种子培养基（牛肉膏0.5%、蛋白胨0.3%、酵母粉0.5%、淀粉1.0%、氯化钙0.5%、蔗糖1.0%、pH=7.0）。

1.1.3 试验仪器 液相色谱四级杆飞行时间质谱Agilent 1260/6520（美国安捷伦科技公司）;电子天平（瑞士梅特勒·托利多仪器有限公司）;恒温培养振荡器（上海智城分析仪器有限公司）;pH计（德国赛托利斯公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备 芽胞杆菌菌株划线培养活化24 h后，接入20 mL种子培养基， 于37℃ 200 r·min-1条件下培养12 h， 成为种子液。按1%接种量接入50 mL胰酪大豆胨液体培养基中，于 37℃ 200 r·min-1培养48 h，形成发酵液。每种芽胞杆菌发酵液各取50 mL， 经离心后取上清液， 上清液过微孔滤膜（0.22 μm）后，加入样品瓶。样品制备后置于4℃冰箱保存，等待进样。

1.2.2 样品检测 （1）色谱条件：色谱柱采用Agilent ZORBAX Extend C18（2.1 mm×50 mm， 1.8 Micron）;流动相为10 mmol·L-1乙酸铵水溶液（A相）和甲醇（B相）;梯度：0～8 min 5% B;38～45 min 95% B;47～55 min 5% B;流速：0.3 mL·min-1;柱温：30℃;进样量：2 μL;（2）质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式;干燥气温度：350℃，干燥气流速：5 L·min-1;毛细管电压：3500 V;裂解电压：100 V;雾化器压力：40 psig;Skimmer：65.0 V;质量范围：100～3000 m/z。

1.2.3 产羟基喹啉基乙酮芽胞杆菌的筛选 用LCQTOFMS对芽胞杆菌的发酵产物进行分析，采用Agilent Mass Hunter软件，对所获得的数据进行分子特征提取（MFE），并通过Metlin代谢物质谱数据库进行检索，获得总体代谢物的信息。从中筛选产羟基喹啉基乙酮（Quinacetol）的菌株样本。记录保留时间、精确分子量、质核比、相对含量和匹配得分等数据。

1.2.4 芽胞杆菌来源的羟基喹啉基乙酮成分分析 利用分子特征提取质谱图，根据电离模式、质谱图判断加合离子类型，根据质荷比推断质量数和分子式，并进一步计算样品中测得的羟基喹啉基乙酮的精确分子量及质量偏差。

2 结果与分析

2.1 产羟基喹啉基乙酮芽胞杆菌的筛选

由表1可知，从56个芽胞杆菌菌株发酵液的代谢物中，筛选得到产羟基喹啉基乙酮的菌株有6株，分别为土壤芽胞杆菌FJAT14232（Bacillus soli）、枯草芽胞杆菌FJAT8784（Bacillus subtilis）、波茨坦短芽胞杆菌FJAT10006（Brevibacillus borstelensis）、浸麻类芽胞杆菌FJAT14204（Paenibacillus macerans）、嗜碱芽胞杆菌FJAT10014（Bacillus alcalophilus）和米氏解硫胺素芽胞杆菌FJAT14205（Aneurinibacillus migulanus）。

在与Metlin谱库匹配度方面，匹配得分均大于95.35%，其中嗜碱芽胞杆菌FJAT10014（Bacillus alcalophilus）的谱库检索得分最高，为99.13%;而浸麻类芽胞杆菌FJAT14204（Paenibacillus macerans）的得分最低，为95.35%。

羟基喹啉基乙酮占各芽胞杆菌总代谢物的相对含量，均高于1.17%。其中，最高的为土壤芽胞杆菌FJAT14232（Bacillus soli），占其总代谢物相对含量的1.68%;而米氏解硫胺素芽胞杆菌FJAT14205（Aneurinibacillus migulanus）相对含量最低，占其總代谢物相对含量的1.17%。

2.2 芽胞杆菌来源的羟基喹啉基乙酮成分分析

芽胞杆菌发酵产物中羟基喹啉基乙酮（Quinacetol）的提取化合物色谱图，见图1～2。在提取化合物色谱图中，横坐标代表保留时间（min），纵坐标则代表响应值。结果表明，土壤芽胞杆菌FJAT14232（Bacillus soli）的羟基喹啉基乙酮提取峰的响应值最高，为1.14×106;而米氏解硫胺素芽胞杆菌（Aneurinibacillus migulanus）FJAT14205的响应值最低，为7.40×105。

以枯草芽胞杆菌FJAT8784为例，利用分子特征提取羟基喹啉基乙酮的质谱图（图3）。由于本试验采用正离子的电离模式，该模式下产生[M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+、[M+K]+等分子离子。结合该化合物的鉴定结果（图4），判断质荷比为205.0972的峰为[M+NH4]+加合离子，根据计算推断该成分的质量数为187.0638，分子式为C11H9NO2，为羟基喹啉基乙酮（Quinacetol）。

进一步计算芽胞杆菌样品中测得的羟基喹啉基乙酮的精确分子量及质量偏差，见表3。结果表明，质量偏差分布范围为-0.53×10-6～6.41×10-6。其中，偏差最小的为波茨坦短芽胞杆菌FJAT10006，为-0.53×10-6;而质量偏差相对大的为土壤芽胞杆菌FJAT14232和浸麻类芽胞杆菌FJAT14204，实测值与理论值偏差都为6.41×10-6。

3 讨论

喹啉类化合物是一类重要的含氮杂环，具有低毒、高效、对环境友好、结构变化多样等特点[7]。目前，以喹啉环为母核设计，合成新的抗菌化合物受到研究者关注，4羟基喹啉类、6羟基喹啉类、8羟基喹啉类、喹啉酰胺类、二氯喹啉酸类等衍生物研究较为深入[16]。然而，从天然产物中获取喹啉类化合物的研究还较少，其中芽胞杆菌产喹啉类化合物还未见报道。

液相四级杆飞行时间质谱（LCQTOFMS）技术具有高灵敏度、高分辨率、高选择性[17]的特點，本研究将该技术应用在微生物功能成分的检测和筛选中。以芽胞杆菌属及其近缘属的56个菌株为样本，筛选产喹啉类化合物的菌株资源。共获得产羟基喹啉基乙酮（Quinacetol）的菌株6株，分别为土壤芽胞杆菌FJAT14232（相对含量为1.68%）、枯草芽胞杆菌FJAT8784（相对含量为1.53 %）、波茨坦短芽胞杆菌FJAT10006（相对含量为1.53%）、浸麻类芽胞杆菌FJAT14204（相对含量为1.39%）、嗜碱芽胞杆菌FJAT10014（相对含量为1.26%）和米氏解硫胺素芽胞杆菌FJAT14205（相对含量为1.17%）。羟基喹啉基乙酮相对含量的分布范围为1.17%～1.68%，其中最高的是土壤芽胞杆菌FJAT14232，相对含量达到1.68%。采用分子特征提取（MFE）与Metlin谱库检索获得化合物信息，6个样本的谱库得分（Score）均大于95.35，其中嗜碱芽胞杆菌FJAT10014的最高，得分为99.13。通过对羟基喹啉基乙酮精确分子量的检测值与理论值计算质量偏差，结果表明质量偏差范围为-0.53×10-6～6.41×10-6，满足了高分辨质谱的定性需求。

芽胞杆菌能产生丰富的抗菌物质[18]，活性物质和活性菌株的筛选有重要的应用价值。本研究为芽胞杆菌来源的抗菌化合物的开发与利用提供了一些前期基础，然而羟基喹啉基乙酮的生物活性，还有待进一步分离、提纯与生测。另外该成分是否为羟基喹啉基乙酮或是羟基喹啉基乙酮的同分异构体， 有待进一步验证。

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（责任编辑：柯文辉）