环境中抗药菌株的分离、鉴定及其抑菌活性研究

阎春兰 央青卓玛 韦英美 王涛 雷世庭 王磊

摘要：采用革兰氏染色技术、生理生化试验和16S rDNA序列分析，对分离筛选自土壤中的抗药菌株进行鉴定；测定菌株的生长曲线了解菌株的生长情况；耐药性和抑菌性试验检测菌株的特性。结果表明，从土壤中分离得到11种抗药菌株，经鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas）、贪噬菌属（Variovorax）、溶杆菌属（Lysobacte）和短芽孢杆菌属（Brevibacillus）等。其中，菌株XC-10、XN-4、XN-5和XN-6等分别对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和藤黄微球菌（Micrococcus luteus）等细菌的生长有不同程度的抑制作用；11种菌株分别对终浓度为10 μg/mL壮观霉素和20 μg/mL氨苄青霉素等具有显著的耐药性。

关键词：抗药菌株；分离鉴定；16S rDNA；抑菌特性

中图分类号：Q93-331 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）10-0060-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.10.014

Isolation，Identification and Antimicrobial Traits of Antibiotic

Resistant Strains in Environment

YAN Chun-lan，YANG-QING Zhuo-ma，WEI Ying-mei，WANG Tao，LEI Shi-ting，WANG Lei

（College of Life Sciences，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China）

Abstract： By using Gram stain， physiological property and phylogenetic trees based on 16S rDNA，the different antibiotic resistant strains which were screened and isolated from soil were identified. Then the growth chart of strains were measured，and the drug resistance and the antimicrobial characteriatics were detected. The results showed that 11 antibiotic resistant strains were isolated and identified from soil. According to morphological characteristics and the phylogenetical analysis of 16S rDNA，these strains were determined to belong to Pseudomonas， Variovorax， Lysobacte and Brevibacillus. And the strains of XC-10，XN-4，XN-5 and XN-6 had different inhibitory effects on the growth of bacteria such as Staphylococcus aureus，Bacillus subtilis，and Micrococcus luteus. Screened had obvious inhibiting effect on six common indicator strains. The 11 strains all showed significant drug-resistance to the final concentration of 10 μg/mL spectinomycin and 20 μg/mL ampicillin.

Key words： antibiotic resistant strains； isolation and identification； 16S rDNA； antimicrobial characteriatics

抗生素是在動植物或者微生物上提取的能够杀灭病菌的代谢产物[1]，是人类对抗细菌感染的有效手段。近些年来，传统的放线菌、链霉菌和少数细菌产生的抗生素已不能对抗大部分病原菌[2]，细菌耐药性问题越来越受到人们关注[3，4]，而有些细菌天然的对一种以上的药物具有耐受性[5]，出现了大量的超级细菌如耐青霉素肺炎菌（Penicillin-resistant Streptococcus pneumonia，PRSP）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）和耐万古霉素肠球菌（Vancomycin-resistant Enterococcus，VRE）等[6，7]。针对目前耐药性日益严重的问题，除继续开发传统的抗生素外，也进行了新型的抗耐药菌抗生素的研发，尤其是一些新结构类别抗生素和（半）合成抗生素的研究开发[8]，以及非抗生素疗法，如噬菌体及噬菌体裂解酶疗法[9]、CRISPR-Cas9等的应用[10]。也有研究表明，细菌产生的细菌素，与其他的细菌素、抗生素、噬菌体裂解酶或者其他的抗微生物药物结合，可以用于防治病原菌[11]。本研究自青海西宁污水区和四川西昌医院附近的土壤中分离筛选抗药性菌株，初步了解其培养特征、形态特征，通过16S rDNA序列分析及生理生化试验鉴定菌株。检测菌株的耐药性和抑菌性，为寻找高效新型抗菌药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验筛菌土样采集于青海西宁污水区的土壤，以及四川西昌医院附近的土壤。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH 7.0～7.2，琼脂粉15～20 g，去离子水补充至1 000 mL。

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸出物5 g，NaCl 10 g，pH 7.0～7.2，琼脂粉15～20 g，去离子水补充至1 000 mL。

1.2 抗药性菌株的筛选、纯化与鉴定

称取10 g采集到的土样，加入至90 mL含有玻璃珠的无菌水中，200 r/min振荡15～20 min。吸取1 mL振摇后的液体，加入至含有9 mL无菌水的试管中，混匀，进行梯度稀释。分别吸取0.1 mL 10-3、10-4、10-5、10-6稀释度的液体，均匀涂布到含终浓度为50 μg/mL氨苄青霉素（记为Ap50）和终浓度为10 μg/mL卡那霉素（记为Km10）的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，37 ℃条件下培养48 h。挑取形态特别、生长良好的单菌落，划线于Ap50或Km10牛肉膏蛋白胨固体培养基上，依此挑取单菌落划线纯化5～6次，以获得纯化的抗药性菌株。

将上述纯化得到的单菌落，接种于Ap50或Km10牛肉膏蛋白胨固体培养基上，37 ℃培养48～64 h。进行革兰氏染色，以确定菌株类别。在光学显微镜下观察菌株大小、颜色和形态等特征。

挑取上述纯化后的单菌落，进行生理生化试验。生理生化指标[12]包括吲哚试验、甲基红试验、伏普试验和柠檬酸盐试验。

提取菌株总DNA[13，14]。参照文献[13]的方法扩增菌株16S rDNA。用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AxyPrep，杭州，中国）纯化回收16S rDNA产物。将纯化后的16S rDNA与克隆载体pMD18-T于16 ℃条件下连接12 h，然后將连接产物转化至E. coli DH5α感受态细胞中，均匀涂布至含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37 ℃条件下培养16 h。挑取阳性克隆，送至天一辉远生物技术有限公司进行测序。将测序得到的16S rDNA序列与NCBI中已知菌株的16S rDNA序列进行比对，使用Mega 5.0软件构建系统进化树。

1.3 菌株生长曲线的测定

将上述纯化得到的菌株接种至5 mL Ap50或Km10牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于37 ℃、200 r/min条件下培养24 h。按照5%接种量接种上述细菌母液至5 mL Ap50或Km10牛肉膏蛋白胨液体培养基中，依次培养0、2、4、8、12、16、20、24或36 h。待培养结束后，于600 nm波长下测定菌液吸光度。

1.4 细菌耐药性试验

将上述纯化得到的菌株分别接种至含有终浓度分别为2 μg/mL的四环素（记为Tc2）、20 μg/mL的氨苄青霉素（记为Ap20）、20 μg/mL的卡那霉素（记为Km20）、5 μg/mL的庆大霉素（记为Gm5）、50 μg/mL的链霉素（记为St50）、10 μg/mL壮观霉素（记为Sp10）、2 μg/mL的氯霉素（记为Cm2）的牛肉膏蛋白胨固体培养基中，于37 ℃条件下培养24 h或48 h，观察菌落生长情况。

1.5 细菌抑菌性试验

细菌的抑菌性试验参照文献[15]进行，挑取上述纯化的单菌落分别接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 ℃培养16 h，吸取上述各菌液100 μL，加入至涂布有大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、嗜线虫沙雷氏菌（Serratia nematodiphila）和产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）（作为指示菌）的牛肉膏蛋白胨固体培养基上的牛津杯中，于37 ℃条件下培养24～48 h，观察菌落生长情况。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离及鉴定

分离筛选得到11株抗药性菌株，依次命名为XC-1、XC-2、XC-4、XC-7、XC-10、XC-11、XN-1、XN-4、XN-5、XN-6和XN-9。11株菌株具体形态特征如表1所示，菌落颜色为黄色或乳白色；除菌株XC-4、XC-11和XN-6菌落表面凹陷或皱缩外，其余菌株的菌落表面光滑。除菌株XC-7和XN-9为球状外，其他菌株形态为短杆状或长杆状；此外，菌株XC-11、XN-1和XN-4具有芽孢结构，其他8种菌株均无芽孢。革兰氏染色结果表明，菌株XC-1、XC-4、XC-7、XN-1、XN-6和XN-9为革兰氏阳性菌，其他菌株均为革兰氏阴性菌。生理生化试验表明，这11种菌株的吲哚试验和伏普试验均呈阴性，除菌株XC-7和XN-1外，其他菌株的甲基红试验均为阴性。此外，除菌株XC-11外，其他菌株的柠檬酸盐试验均为阴性。

将11种菌株的16S rDNA序列上传至NCBI中，与已知菌株的16S rDNA序列进行比对，构建的系统进化树如图1所示。由图1、表2可知，菌株XC-1的16S rDNA序列与纤维单胞菌属的16S rDNA序列（登录号：NR_119095.1）相似性达98%，且两者处于系统进化树的同一分支上。基于形态学观测、生理生化试验及16S rDNA序列分析可知，菌株XC-1属于纤维单胞菌属，其他10种菌株被鉴定为假单胞菌属和短芽孢杆菌属等。

2.2 菌株生长情况的测定

如图2所示，11株菌株在0～4 h，生长缓慢，处于延滞期；在4～16 h，菌株均快速繁殖，处于对数期；到16 h后，11种菌株的生物量基本达到最大值，到24 h后，OD600 nm减小，菌株进入衰亡期。根据11种菌株的生长曲线，可选取16 h后的菌株作为起始菌株进行扩大培养。

2.3 菌株的耐药性检测

使用四环素和氨苄青霉素等7种抗生素对11种菌株进行耐药性检测，由表3可知，耐药性处理24和48 h后，各菌株的生长情况基本不变；20 μg/mL卡那霉素（Km20）对菌株XN-1的生长具有抑制作用，对菌株XC-2、XC-7、XC-11的生长具有较弱的影响，而菌株XC-4、XC-1、XC-10、XN-4、XN-5、XN-6对Km20有较强的耐药性；5 μg/mL庆大霉素（Gm5）对菌株XN-1的生长具有抑制作用，对XC-4、XN-4、XN-5、XN-6、XN-9菌株的生长具有较弱的影响，而菌株XC-1、XC-7、XC-11对Gm5有较强的耐药性；50 μg/mL链霉素（St50）对菌株XC-1、XC-2、XN-1和XN-5的生长均具有抑制作用；此外，11种菌株分别对10 μg/mL壮观霉素（Spe10）和20 μg/mL氨苄青霉素（Amp20）呈现不同程度的耐药性。菌株XN-1除对Spe10和Amp20具有耐药性外，对其余检测的抗生素均不具有耐药性。

2.4 菌株的抑菌性检测

筛选纯化得到的11种菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、嗜线虫沙雷氏菌和产气肠杆菌（作为指示菌）生长的抑制作用如表4所示。XC-1、XC-2、XC-4、XC-7、XC-11、XN-1和XN-9的代谢产物对6种指示菌的生长均没有抑制作用。此外，菌株XC-10、XN-4、XN-5和XN-6的代谢产物能不同程度地抑制部分指示菌的生长。其中，菌株XN-5的代谢产物对所有指示菌的生长均具有抑制作用。

3 小结与讨论

从土壤中分离得到11种抗药菌株，经鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas）、贪噬菌属（Variovorax）、溶杆菌属（Lysobacte）和短芽孢杆菌属（Brevibacillus）等。链霉菌属、枯草芽孢杆菌属和假单胞菌属等是常见的能够产生抗生素的微生物[16-18]，同属的菌株在形态特征和生理生化特性等方面往往会有相似之处。已有的研究结果可以为进一步研究已鉴定种类的微生物的抗菌特性等提供线索[19]。

在检测中，11种菌株中有10株，即分离到的菌株中有90.91%的菌株，对6种以上的抗生素具有不同程度的耐药性，占到检测抗生素的85.71%，表明自然环境中菌株的多种耐药性已非常严重，与前人的研究结果一致[20]。细菌耐药性，尤其多重耐药性的产生是一个世界性的公共卫生难题[21，22]，加大了抗感染治疗的难度，如大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌等对碳青霉烯类等抗生素的耐药率较高[23]。本研究中的多个菌株对各种不同抗生素均呈现不同的耐药性，为后期探索菌株中抑菌性物质与抗生素的结合用于防治病原菌奠定了基础。

XC-10、XN-4、XN-5和XN-6为分别来源于不同菌属的细菌，包括贪噬菌属（Variovorax）、劍菌属（Ensifer）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）和短芽孢杆菌属（Brevibacillus）。这些细菌能够明显抑制常见微生物的生长，但其机制不明，因此分离纯化这些抗药菌株代谢产物中的有效成分，并将其与抗生素相结合，应用于病原菌的防治等，均有待进一步的研究。

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