海洋生物金属硫蛋白开发利用研究进展

朱晓莹 孟霄 姚海洋 许星鸿

摘要：金属硫蛋白（Metallothionein，MT）是一类普遍存在于生物体内的富含半胱氨酸且可以结合金属的特殊蛋白质。就MT的理化性质、生理功能以及开发利用进行了总结，着重介绍了海洋生物MT的特点以及研究现状，并对其今后的研究方向提出了展望。

关键词：金属硫蛋白；海洋生物；生理功能；开发利用

中图分類号：Q178.53 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）10-0009-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.10.002

Research Progress on the Development and Utilization of Metallothionein

of Marine Organism

ZHU Xiao-ying1，MENG Xiao1，YAO Hai-yang1，XU Xing-hong1，2

（1.College of Marine Science & Technology，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，Jiangsu，China；

2.Marine Resources Development Institute of Jiangsu，Lianyungang 222005，Jiangsu，China）

Abstract： Metallothionein（MT） is a class of proteins that are commonly found in organisms with small molecular weight， rich in cysteine， which can bind to metals and have multiple isomers. The research progress of MT was summarized， including the physical and chemical properties； The physiological function， the development and utilization of MT of the marine organism was mainly introduced. The prospects of the research field were also presented.

Key words： metallothionein； marine organism； physiologic function； development and utilization

美国学者Mackay等[1]于1957年在马的肾中首次发现并分离出了金属硫蛋白（Metallothionein，MT）），随后在动物、植物和微生物体内均发现含有MT，且不同物种组织器官中的MT所含氨基酸的数目及构成不同[2]。目前关于MT的研究已涉及到农业、医药、保健、生物工程、环境保护等多个领域。作者总结了MT的特性及目前开发利用的研究概况，着重分析了海洋生物MT的研究现状，并对该领域的研究方向提出了展望。

1 MT的理化性质

MT在生物进化上高度保守，具有相对分子质量低（6～7 kD）、富含半胱氨酸（25%～30%）、组氨酸含量少、缺乏芳香族氨基酸并能结合金属离子等特性[3]。几乎所有MT具有Cys-X-Cys（X为除Cys以外的其他氨基酸）特征序列，并存在多种异构体，且分布于不同的生物及组织器官中[4]。MT的等电点一般在4左右，但不同种属MT的等电点有差异。哺乳动物MT的等电点为3.9～4.6，目前已经发现的水生生物MT的等电点为3.5～6.0。MT的存在形式及其稳定性与其是否结合了金属离子、结合的金属种类以及所在环境的pH密切相关[5]。同样，MT的光吸收特征除了与氨基酸组成有关外，也与它所结合的金属种类密切相关。

2 MT的生理功能

2.1 清除体内自由基和抗辐射作用

在生物体新陈代谢过程中，细胞的各项生命活动会不断产生具有强氧化性的自由基，这会对机体造成氧化损伤；而MT可以清除自由基、抑制脂质过氧化、促进免疫功能和细胞代谢，从而提高机体的自我保护和修复能力，是已知的内源性自由基清除剂中最强的一种[6]。研究表明，百草枯处理后的正常野生型小鼠（Mus musculus）的损伤程度显著低于MT缺失小鼠，表明MT对机体具有保护作用[7]。高剂量Zn-MT可提高小鼠谷胱甘肽过氧化酶活力、降低肝脏过氧化脂质和心肌脂褐质含量，表明MT具有抗氧化及增强免疫力的作用[8]。研究表明，MT具有保护细胞免受辐射损伤的功能，在口服MT后进行辐射处理的小鼠能够延长存活时间[9]；用转MT基因的平菇[Pleurotus ostreatus（Jacq.）P. Kumm.]饲喂小鼠后进行辐射处理，结果小鼠的损伤程度较小[10]。

2.2 调节机体发育、增强应激能力

在不同物种以及不同发育阶段，MT含量存在较大差异，如大鼠（Rattus norvegicus）、小鼠和家兔（Oryctolagus cuniculus f. domesticus Gmelin）等在胚胎期和刚出生时，肝脏中MT含量最高，而人和豚鼠（Cavia porcellus f.）等在怀孕中期或晚期最高[11]。MT含量在胎鼠、新生鼠的肝细胞核当中较高，随着发育核中MT含量逐渐降低，主要存在于细胞质中，表明MT在细胞内的定位也与发育过程有关[12]。研究发现，肿瘤细胞分化程度越小其核中MT的含量越高，其调控细胞分化主要是通过调节细胞中金属离子而影响有关基因的表达[13]。有研究者认为，细胞核中高含量的MT有保护细胞DNA和抑制细胞凋亡的作用[14]，当机体的组织器官中MT基因表达水平下调或缺乏时，对细胞凋亡更敏感；同时，当机体处于不良环境或者受到各种致病因子的侵害时，MT基因表达上调，表明MT具有增强机体应激能力的作用。

2.3 重金属的解毒功能

MT特殊的结构序列（Cys-X-Cys）赋予了MT具有螯合金属离子这一重要的功能[15]。MT基因敲除后的小鼠在重金属胁迫下死亡率显著高于正常小鼠，表明MT能够削弱重金属危害而对机体起到保护作用[16]。Cd处理后，果蝇（Droaophil melanogaster）MT基因表达上调、MT含量显著升高，表明果蝇可通过体内MT基因高表达保护机体免受损害[17]。中华稻蝗（Oxya chinensis Thunberg）在Cd胁迫下，MT基因的表达和Cd蓄积状况均显示出明显的剂量-效应关系[18]。对水生动物MT的研究结果表明，机体内重金属的转运和积累也与MT有关[19]。

2.4 MT与肿瘤

已有研究发现，MT参与肿瘤细胞的分化、增生及凋亡过程[20]。MT和其他一些肿瘤标志物如P53、PCNA、VEGF等之间的联系进一步证明MT与细胞增生相关[21，22]。MT可保护细胞抵抗重金属和烷化剂的致癌、致突变作用，可用于肿瘤临床的辅助治疗和肿瘤标志物标识[23]，这对肿瘤的临床诊断与治疗具有重要意义。于立博等[24]用不同浓度鹰嘴豆（Cicer arietinum L.）MT提取液对人肺癌细胞株（A549）、人胃癌细胞株（MGC-803）、人乳腺癌细胞株（Bcap-37） 进行传代培养，观察了肿瘤细胞的抑制率和凋亡率，结果发现肿瘤抑制率和细胞凋亡率均增加，表明鹰嘴豆MT可抑制肿瘤细胞增长，促进肿瘤细胞凋亡。

3 海洋生物MT的研究现状

近年来，随着工业的高度发展，重金属对海洋环境的污染日益严重，威胁着人类健康，因而海洋环境重金属污染的防治问题越来越受到人们的关注。MT的重金属解毒功能使得对海洋生物MT的研究亦逐渐增多。迄今国内外对海洋生物MT的研究主要集中于海洋动物，而对海洋植物、微生物等的MT研究相对较少。

3.1 海洋动物

3.1.1 海洋脊椎动物 鱼类是现存脊椎动物亚门中种类最多的生物类群，广泛分布于全世界各个水域，绝大多数生活在海水中。随着海洋水环境的污染，鱼类MT基因作为生物标志物已越来越多地应用到水环境重金属污染的监测上。许氏平鲉（Sebastes schlegelii Hilgendorf）幼体在含不同浓度砷的水体中胁迫20 d后，其MT基因的表达显著增加[25]。泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）在不同浓度Cd胁迫时，Cd浓度越高、胁迫时间越长，MT基因的相对表达水平越高[26]。目前报道多为针对重金属单因素对鱼类MT基因表达的影响研究[25-27]，而复合污染对鱼类MT基因表达的影响以及重金属胁迫下鱼类MT基因表达有无种属和性别差异等方面的文献较少。陈春亮等[28]通过Hg、Cd单一和混合暴露试验，分析了水体中Hg和Cd急性污染对紫红笛鲷（Lutjanus sanguineus Cuvier）肝组织MT的胁迫效应，结果发现，单一、混合暴露下皆有明显的时间-效应关系和剂量-效应关系，但混合暴露浓度组的诱导率总体上低于单一暴露下的诱导率，说明Hg、Cd混合状态下具有拮抗作用。Beg等[29]分别用重金属胁迫黄鳍鲷（Acanthopagrus latus Houttuyn）和半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Gunther）后发现，与半滑舌鳎相比，黄鳍鲷肝脏和鳃組织中的重金属和MT浓度较高，表明MT基因的表达存在种属差异。谢晴等[30]用Cd分别胁迫雄性和雌性黑点青鳉（Oryzias melastigma Mc Clelland）的试验表明，在相同浓度Cd胁迫下，雄性黑点青鳉肝脏MT基因的表达比雌性更敏感。这是首次报道在重金属胁迫下，鱼类MT基因的表达具有性别差异。因此，利用生物标志物监测水环境重金属污染状况时，还应当考虑动物的性别差异。

3.1.2 海洋无脊椎动物 对海洋无脊椎动物MT的研究多为分析不同组织中MT基因的分子特征及金属离子蓄积状况。哺乳动物的MT通常有61个氨基酸，同源性较高，而海洋无脊椎动物MT序列含有约70个氨基酸，同源性较低。如马氏珠母贝（Pinctada martensii Dunker）MT基因cDNA序列全长为512 bp，开放阅读框为237 bp，编码78个氨基酸[31]。从三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus Miers）精巢中也克隆到了MT基因的cDNA序列，其中MT-1全长为450 bp，编码58个氨基酸，含有19个半胱氨酸；MT-2全长581 bp，编码59个氨基酸，含有18个半胱氨酸，MT-1和MT-2与无脊椎动物（尤其是蟹类）的MT同系物更相似[32]。因此，海洋无脊椎动物的MT随物种不同有较大差异，其进化可能是一个趋同进化过程，即越高等的动物其MT越趋向于稳定。

大量研究表明，海洋无脊椎动物MT的表达以及组织内重金属蓄积具有组织和种属特异性，且组织中MT与重金属有剂量依赖性[33]。蒋国萍等[34]在斧文蛤（Meretrix lamarchii Deshayes）5种组织中均检测到有MT表达，且存在组织特异性；在相同金属离子浓度胁迫下，近江牡蛎（Ostrea rivularis Gould）对Cd的富集能力大于Pb[35]；幼年刺参（Stichopus japonicus Selenka）在Cd胁迫36 h后，其各组织间MT含量有显著差异[36]。在测定巴伊亚布兰卡河口沉积物中的重金属含量时，发现该地区雄蟹体内MT含量比雌蟹高[37]。Angela等[38]发现在Cd胁迫下，牡蛎（Saccostrea sp.）消化腺中MT含量显著升高，而卵母细胞中卵黄蛋白原含量明显下降，推测MT和卵黄蛋白原2种蛋白质表达在Cd胁迫下存在一定的交互作用。

3.2 海洋植物

目前对海洋植物MT的研究多集中于藻类。Naoto等[39]报道，小球藻（Chlorella sorokiniana L.）MT可被Cd诱导，并对其进行了分离纯化。Morris等[40]亦从墨角藻（Fucus vesiculosus L.）分离出了MT。实验室内重金属培养和养殖区培育的海带（Laminaria japonica Arsch）随时间和浓度变化对Cu、Zn和Cd呈现不同程度的富集能力，MT在Cu和Cd单因素诱导下呈现递减趋势，而Zn诱导后呈现递增趋势，在多元素诱导下呈现递减趋势[41]。用不同浓度的锌盐对处在对数生长期的小球藻分别胁迫培养后，锌离子浓度为5 μmol/L时，对小球藻生长产生显著抑制，且抑制程度随锌离子浓度的增加而增大；锌离子浓度为50 μmol/L时，诱导产生的锌结合MT量达到最高[42]。

3.3 海洋微生物

近年来，随着核工业的迅速发展，对含铀废水的回收处理已成为新的研究热点，有研究表明，微生物对铀离子具有很强的吸附作用[43]。李敏[44]研究发现，克隆有MT基因的工程菌细胞对铀离子的吸附量显著高于野生型菌株细胞，且其吸附速度更快、吸附量更大。秦配玲[45]报道，转MT组成型表达絮凝酵母SPSCO1pcr对Cr的还原速率比出发菌株SPSCO1提高40%，SPSCOlpcr对总Cr、Cu和Cd的去除率分别为61.13%、75.73%和57.28%，均高于出发菌株SPSCO1和转MT诱导型表达絮凝酵母SPSCO1pr的去除率。

4 MT的开发利用

4.1 MT在海洋环境监测中的应用

MT分布广泛且具有重金属解毒功能，可作为生物标志物用来监测海洋水体环境重金属的污染程度。而随着对MT研究的深入，发现在重金属胁迫下，海洋生物体内MT基因的表达量不仅与所处环境中重金属的含量有关，还受其他环境因素（金属离子、温度、O2、pH等）的影响[46，47]。因此，今后的研究应充分考虑其他环境因素与MT表达量的关系，这将有望提高MT的重金属解毒能力以及作为生物标志物来检测海洋环境污染的精确度，对于海洋生态环境保护具有重要意义。

4.2 MT在医药领域中的应用

医学临床研究表明，MT与肿瘤、心血管和神经系统等疾病密切相关[48，49]。虽然各种疾病发生的原因十分复杂，但其诱发的重要原因之一是脂质过氧化水平过高；而MT可以清除体内自由基，降低机体的脂质过氧化水平，促进细胞新陈代谢、增强机体免疫能力和抗辐射损伤等，对疾病的辅助治疗具有较好的效果[50]。另外在某些微量元素缺乏症、口腔溃疡、胃溃疡，风湿性关节炎、抗炎、抗感染等方面MT也能发挥积极作用[51]。

4.3 MT在保健食品行业中的应用

随着人们保健意识的逐渐提高，市场对营养保健品的需求量越来越大。天然活性物质MT除了可以制成药物制剂外，还可添加于功能食品或直接制成可食用的产品，如具有抗衰老、抗辐射、降血脂以及护肤美容等功效的片剂和功能饮料能降低氧化损伤程度、促进血液循环、补充微量元素和增强免疫能力，可以延缓衰老和预防各种疾病的发生[52，53]。

4.4 MT在化妆品领域的应用

随着时代的发展，形形色色的化妆品大量涌现于市场，其中人们最熟悉的就是含有超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等抗氧化成分的化妆品。有关研究表明，MT也具有抗氧化等多种功效，且与SOD相比具有清除自由基、抗氧化和抗辐射能力强、半衰期长、热稳定性高、分子量小、易被机体吸收等优点，而且MT是内源性蛋白，安全性能好，在机体中有着不可替代的作用[54]，因而可以作为化妆品添加剂应用，起到抗衰老、抗辐射、清除色素、抗感染等作用，同时也可替代化学性化妆品，以减轻对人体造成的毒害作用[55]。

5 展望

MT作为具有结合金属功能的天然活性物质，有望在环保、农业、医药、保健、化妝品以及生物化工等领域进行开发利用。目前，对于不同海洋生物MT的分子结构及功能、基因克隆与表达等方面的研究日益深入，但其作用机制尚不明晰，有待进一步确认，并且海洋生物MT各异构体的具体功能及其存在差异的原因有待阐明。海洋生物MT具有种属和组织特异性，因此要选择合适的物种和组织器官进行海洋环境监测与风险评估，并且要建立和完善快速灵敏、特异性强的检测方法。在研究重金属对海洋生物于分子水平上的作用机制时，要考虑多种重金属复合作用以及环境因子对海洋生物组织器官蓄积重金属、解毒机制和解毒途径的影响，为进一步研发高效、无污染的重金属解毒剂、治理海洋水体污染以及提高食品安全奠定理论基础。以海洋藻类MT为标志物来指示海洋环境中重金属污染状况以及对重金属造成的海洋水体污染的修复具有较大的潜力，可利用基因工程技术，将MT固定于微生物里，开发新型、高效的生物吸附材料，这将为废水的处理回收、减少环境污染提供有效的技术手段。在MT可作为生物药物成分而制成各种剂型的治疗药物推广应用于临床医学方面，亦可作为既能补充营养、又具调节功能的新型保健食品以及化妆品添加剂，这也具有广阔的应用前景。

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