司美格鲁肽对链脲佐菌素诱导的糖尿病心肌病大鼠的保护作用及其机制研究

华炳红，张菊云，郑地明，黄辛欣

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一种不同于器质性心血管疾病的特异性心肌病变，是糖尿病的常见并发症之一[1]。高糖诱导的细胞因子激活与细胞凋亡、炎性反应和微血管内皮下纤维组织增多等方面密切相关，参与DCM发病与心肌损伤[2-3]。因此，预防和改善糖尿病患者心肌微循环纤维化和炎性损伤具有重要的临床意义。胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一种肠促胰岛素，可通过调控β细胞的增殖、再生和凋亡，显著降低患者糖化血红蛋白和体质量，减轻炎性反应，从而改善心肌损伤[4-5]。司美格鲁肽是GLP-1的类似物，临床研究表明，其在血糖控制和心血管疾病长期预后中表现出良好的有效性和安全性[6]。但其对糖尿病并发症,特别是对DCM的作用尚未可知。本研究拟分析司美格鲁肽对DCM心肌结构、炎性反应和血管生成方面的影响及作用机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验动物：SPF级雄性SD大鼠60只，8～10周龄，体质量200～250 g，均购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SYXK(京)2019-0010。严格控制(25±1)℃恒温、50%恒定湿度的标准通风饲养环境，每日12 h规律明暗交替光照，普通饲料适应性喂养1周。(2)药品与试剂：链脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，司美格鲁肽(上海凯试生物科技有限公司，纯度99%)，HE染色试剂盒，改良Masson三色染色试剂盒(索莱宝公司)，兔抗α-平滑肌肌球蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗体(Abcam公司)，兔抗TNF-α抗体(Santa Cruz公司)，兔抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体(Sigma公司)，兔抗β-actin抗体(Sigma公司)，山羊抗兔IgG二抗(Abcam公司)，DAB染色液(Dako公司)。(3)仪器设备：TG16-WS/TG16WS台式高速离心机(中国湘仪集团)；Nikon Eclipse E600倒置荧光显微镜(日本尼康公司)；Bio-rad Gel Doc XR+凝胶成像系统(美国Bio-Rad Laboratories公司);BG-102血糖仪(上海罗氏制药有限公司)。

1.2 实验方法 2021年1月—2022年1月于中南大学湘雅医学院附属海口医院进行实验。 60只SD大鼠随机数字表法分为对照组、DCM组和干预组，每组20只。DCM组、干预组构建DCM模型：大鼠于禁食12 h后一次性腹腔注射STZ 70 mg/kg(STZ采用0.1 mol/L、pH 4.2枸橼酸缓冲液配置)，3 d后使用罗氏血糖检测仪检测小鼠血糖水平，随机血糖大于16.67 mmol/L为糖尿病建模成功，检测血糖，将大约6周左右发生DCM的大鼠纳入实验[7]。对照组大鼠腹腔注射等量枸橼酸缓冲液。造模成功后，干预组大鼠每日给予司美格鲁肽腹腔注射给药(10 nmol/kg，溶于0.9% NaCl溶液)，对照组和DCM组以等量生理盐水代替，均连续干预6周。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 心肌组织病理学检测：干预结束后，大鼠禁食不禁水12 h，戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉。脱颈处死，取出大鼠左心室标本，部分组织置于4%多聚甲醛固定24 h以上后，经脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，4 μm厚度切片，行HE和Masson染色，光镜下观察心肌组织病理形态并拍照，利用Image J计算心肌胶原体积分数(CVF)=单视野内胶原面积/心肌总面积×100%。

1.3.2 大鼠血糖、血脂指标测定：末次给药后，不禁食采集大鼠眼内眦静脉血，离心取上清，采用全自动生化分析仪检测血糖(FPG)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。

1.3.3 心肌组织α-SMA和TNF-α表达测定：采用免疫组织化学检测。心肌石蜡切片脱蜡，抗原修复，用3%过氧化氢孵育阻断内源性过氧化物酶活性，分别与兔抗α-SMA多克隆抗体(1∶1 000)和兔抗TNF-α抗体(1∶1 000)4℃孵育过夜。次日，与山羊抗兔IgG二抗在室温下孵育60 min。DAB可视化显色，镜下控制反应时间(1～2 min)。每组准备5张切片，每张切片随机选取5个区域进行分析，应用Image-Pro Plus 6.0测定有α-SMA阳性反应的小血管(即小血管平滑肌增厚且内部直径<50 μm)和TNF-α阳性反应百分比面积。α-SMA和TNF-α的阴性对照组以相同的实验方法处理，但不予抗体孵育。

1.3.4 心肌组织TNF-α和VEGF蛋白表达检测：采用Western-blot法检测心肌组织内TNF-α和VEGF蛋白表达。冰上剪碎心肌组织，利用RIPA裂解液180 μl+蛋白酶抑制剂20 μl对组织样本进行匀浆，冰上裂解30 min。4℃离心取上清。BCA法检测样本蛋白浓度，煮沸变性。应用SDS-PAGE凝胶进行蛋白电泳。湿转将蛋白转移至PVDF膜(Millipore，美国)，8%脱脂牛奶封闭非特异性蛋白1 h，分别孵以TNF-α(1∶500)和VEGF一抗(1∶1 000)，4℃孵育过夜，次日TBST洗膜3次后，二抗(1∶10 000)室温孵育1 h。β-actin作为内参，使用Image-Pro Plus 6.0进行灰度分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌组织病理学观察比较 (1)HE染色：对照组大鼠心肌纤维形态均匀，排列规律紧密，胞核蓝染清晰可见；DCM组大鼠心肌组织出现结构异常变性，表现为异常胞质空泡样变性，心肌细胞排列疏松紊乱，肌纤维肥大断裂；干预组大鼠经药物治疗后，心肌结构紊乱程度降低，心肌排列较DCM组规则，见图1。(2)心肌Masson染色：对照组多为红色为主的心肌纤维和蓝色细胞核；DCM组大鼠心肌组织胶原纤维沉积明显增多，相互交联成网状，排列紊乱，血管周围纤维化明显增多，而干预组大鼠间质胶原纤维减少，心肌纤维化程度得到明显改善。DCM组心肌胶原体积分数(16.3±1.4)%高于对照组的(2.6±0.4)(t/P=42.079/<0.001)，干预组心肌胶原体积分数(6.8±1.7)%显著低于DCM组，差异有统计学意义(t/P=19.292/<0.001)，见图2。

注：A.对照组；B.干预组；C、D为DCM组，表现为心肌细胞破裂(之字形箭头)，空泡化(十字箭头)，间质液(双裂箭头)和红细胞(粗箭头)浸润

注：A.对照组；B.DCM组；C.干预组

2.2 各组大鼠血糖及血脂水平比较 DCM组大鼠血清FPG、TC、TG和LDL-C水平均高于对照组(P<0.01),而HDL-C水平则显著低于对照组(P<0.01)。干预组大鼠血清FPG、TC、TG和LDL-C水平均低于DCM组(P<0.01)，而2组HDL-C水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 3组大鼠血糖、血脂水平比较

2.3 各组大鼠心肌组织TNF-α和α-SMA水平比较 免疫组化结果显示，与对照组相比，DCM组大鼠心肌细胞TNF-α阳性细胞明显增多(P<0.01)；与DCM组比较，干预组阳性细胞降低(P<0.01),见表2、图3。对照组心肌组织中α-SMA表达仅在微动脉平滑肌层内；DCM组大鼠心肌组织α-SMA阳性细胞较对照组明显降低(P<0.01)；与DCM组比较，干预组心肌组织中α-SMA阳性表达水平明显增高，尤其是微动脉周围心肌组织，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2、图4。

表2 各组大鼠心肌TNF-α、α-SMA水平比较

注：A.阴性抗体对照，细胞核呈蓝色，胞浆呈淡蓝色；B.对照组；C.DCM组，箭头代表心肌细胞内棕黄色颗粒样阳性物质增多，并聚合成团；D.干预组

注：A.阴性抗体对照，细胞核呈蓝色，胞浆呈淡蓝色，小动脉侧部分红细胞呈淡蓝色；B.对照组；C.DCM组；D.干预组，箭头代表棕红色α-SMA阳性表达，主要集中于增厚的小动脉平滑肌层

2.4 各组大鼠TNF-α、VEGF蛋白表达比较 Western-blot结果显示，与对照组比较，DCM组大鼠心肌TNF-α蛋白表达量明显增高，而VEGF蛋白表达降低(均P<0.05)。与DCM组比较，干预组大鼠TNF-α蛋白表达降低，而VEGF蛋白表达升高(均P<0.05)。见图5。

图5 各组大鼠心肌组织TNF-α和VEGF蛋白表达比较

3 讨 论

当前全球糖尿病患病率逐年升高，且因血糖控制效果不佳，常伴随不同程度并发症，给患者生活质量带来巨大负担。高血糖作为糖尿病基本病因，可诱发多个系统和器官损害，也可介导炎性反应、细胞凋亡和心肌纤维化，是引起DCM的重要危险因素，且糖尿病患者通常伴有高脂血症，亦可增加心血管疾病的风险[8]。GLP-1是一类治疗2型糖尿病的新型药物，可通过调节β细胞的增殖、再生和凋亡来增强胰岛素分泌、模拟胰岛素作用并抑制胰高血糖素，发挥降糖效果并改善血管内皮功能障碍，而司美格鲁肽作为一种肠道分泌GLP-1类似物可能具有类似效果[9]。多项临床研究表明，司美格鲁肽可有效升高患者心肌梗死后的存活率，改善糖尿病患者心脏功能[6]。本研究结果显示，司美格鲁肽治疗可显著改善DCM组大鼠的高血糖和高血脂状态，说明司美格鲁肽对糖尿病患者具有明显的降糖调脂作用，这些实验结果与Kraljevic等[10]进行的研究结果部分一致，但其作用机制尚需进一步探索。

DCM是与糖尿病特有代谢紊乱有关的一种特异性心肌病变[11-12]。能量代谢紊乱引起的细胞因子和电生理改变，对心肌结构和功能产生损伤。多项研究表明，GLP-1类药物和GLP-1受体激动剂(glucagon-like peptide-1 receptor agonists，GLP-1RA)具有调节心肌纤维化作用，可改善糖尿病患者的心血管功能[13-15]。此外，其还可通过抑制炎性介质(血清TNF-α、IL-6和IL-1β)、氧化应激及P38、核转录因子-κB(NF-κB)信号通路以缓解大鼠DCM[16]。本研究病理组织结构检测发现，DCM组大鼠心肌组织出现大量间质纤维化、炎性细胞浸润、凋亡细胞增多和红细胞异常分布等组织损伤。研究已证实，DCM发展过程中，抗氧化因子在心脏组织中急剧下降，持续增长的ROS刺激转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad3信号通路激活，从而促进几种关键纤维化标志物的表达，如DCM心脏中的α-SMA、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原[17-18]。本研究以尾静脉一次性注射大剂量STZ构建DCM模型，大鼠出现DCM典型生化指标表现，包括高血糖和高血脂等，说明模型构建成功。实验结果显示，STZ诱导的DCM大鼠心肌微动脉平滑肌层内成纤维细胞标志物α-SMA的表达明显降低，提示由成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化增加，导致DCM心肌病理改变和心脏功能障碍，而干预组司美格鲁肽治疗则可显著增加DCM大鼠心肌微动脉内膜α-SMA表达，抑制心肌细胞变性，缓解DCM大鼠心肌纤维化。以上结果提示，司美格鲁肽可显著改善DCM大鼠心肌组织结构病理改变，在结构和分子水平上阻止心肌细胞的退行性改变。

TNF-α是细胞因子网络中的关键成分，具有多种生物学活性，活化的巨噬细胞产生过量TNF-α可介导炎性免疫损伤[19]。Palomer等[20]最近的研究发现，2型糖尿病大鼠心肌组织TNF-α的表达显著增高，其水平与心肌纤维化程度和心室肌重量呈正相关。此外，有研究发现，司美格鲁肽可通过抗炎机制显著降低NF-κB、TNF-α和IL-1β等炎性因子的表达水平，抑制ApoE-/-小鼠和LDLr-/-小鼠的斑块病变发展，这种改变在一定程度上与血糖、体质量和胆固醇降低无关[21-23]。本实验结果显示，DCM模型大鼠心肌组织TNF-α蛋白表达显著升高；同时，免疫组化分析发现，心肌细胞内TNF-α阳性棕黄色颗粒样物质增多，并聚合成团。可见TNF-α参与了DCM病变的发展。此外，司美格鲁肽治疗可显著降低DCM大鼠心肌组织TNF-α的表达和聚集，这表明司美格鲁肽可通过抑制炎性反应发挥DCM心肌保护作用，与文献报道相符[20]。

VEGF作为一种有效的血管生成因子，可刺激内皮细胞增殖，促进侧支循环血管的发育，其在糖尿病患者中的表达降低可能是糖尿病患者心肌梗死高风险的重要因素之一[24]。Maskery等[25]发现，GLP-1受体激动剂可减少脑梗死患者梗死面积、凋亡、氧化应激和炎性反应，并促使血管新生因子VEGF表达的上调，继而增加神经和血管新生。本研究结果表明，司美格鲁肽治疗可显著增加大鼠心肌组织VEGF表达，促进冠状动脉微血管新生，对DCM心肌损伤发挥保护作用。

综上所述，司美格鲁肽可明显改善DCM大鼠心肌组织结构病理改变，它在结构和分子水平上可阻止心肌细胞的退行性改变，对DCM组大鼠的心肌纤维化和炎性反应有明显的保护作用，并且可促进冠状动脉血管新生。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

华炳红：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；张菊云：提出研究思路，分析试验数据，论文审核;郑地明：资料搜集整理，论文修改;黄辛欣：课题设计，分析整理