miR-19a-3p 联合PTEN 基因在胃癌中的研究价值

许可 马冠英 张志刚

胃癌在我国是常见的消化道恶性肿瘤之一,死亡率较高,患者预后较差［1］。有统计数据表明,胃癌患者术后5 年生存率不到1/3［2］。miRNA 是一类非编码小RNA,参与癌症发展过程中的许多重要环节［3,4］。本研究探索miR-19a-3p 与胃癌之间的相关性,旨在为胃癌的诊疗提供新的思路及理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019 年10 月～2020 年10 月因胃恶性肿瘤就诊于沧州市人民医院,并经外科手术后病理结果提示为胃腺癌的24例患者,其中男14例,女10 例,中位年龄68 岁。所有患者均可查到完整的临床病理资料,包括性别、年龄、病史等。以癌灶处的组织为胃癌组织,距离癌灶5 cm 以上的胃组织为正常胃组织。

1.2 材料与试剂 PTEN 抗体试剂(上海杰浩生物技术有限公司)、miRNeasy 石蜡组织核酸纯化试剂盒(QIAGEN)、miRCURY LNA 逆转录试剂盒(QIAGEN Sciences)、miRCURY LNA SYBR Green 染料法PCR检测试剂盒(QIAGEN Sciences)、miR-19a-3p 引物：miRCURY miRNA PCR 引物(QIAGEN Science)。

1.3 实验前准备 将手术后的胃癌组织及正常胃组织标本制备成蜡块,miR-19a-3p 的提取使用5 μm 厚度的蜡卷2 片。PTEN 免疫组化染色使用白片1 张。

1.4 miR-19a-3p 的提取 将蜡卷用二甲苯及无水乙醇脱蜡后,使用miRNeasy 石蜡组织核酸纯化试剂盒进行miRNA 的提取及纯化,将模板RNA 稀释至5 ng/μl,按照说明书要求,在EP 管中按照如下要求配置逆转录体系：2 μl 5x miRCURY STBR Green RT Reaction Buffer,4.5 μl RNase-free water,1 μl 10x miRCURY RT Enzyme Mix,0.5 μl UniSp6 RNA spike-in,然后进行逆转录。

1.5 qRT-PCR 检测miR-19a-3p 的表达情况 按照1∶60 的倍数,将590 μl 的RNaes-free 水加入到上一步中得到的cDNA 中,进行稀释。然后按照如下要求配置扩增体系：5 μl 2x miRCURY SYBR Green Master Mix,1 μl RNaes-free水,1 μl miR-19a-3p PCR引物,3 μl稀释后的cDNA模板。配置好后置于8联管中,离心,放置于PCR 仪上,按如下步骤设置PCR 程序：95℃2 min,95℃ 10 s,56℃ 60 s(收集荧光信号),循环数40个。本实验采用的内参为U6,用以计算miR-19a-3p 的相对表达量。miR-19a-3p 引物由凯杰企业管理(上海)有限公司设计及合成(货号：339306)。使用ΔCt 计算miR-19a-3p 表达量的相对值,即2-△△Ct。

1.6 PTEN免疫组化染色 使用Roche Hotline罗氏诊断产品(上海)有限公司免疫组化机进行染色,染色结果由两名高年资病理医师进行判读,有疑问者请主任医师会诊。

1.7 统计学方法 采用SPSS26.0 统计学软件处理数据。计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-19a-3p 表达情况 采用qRT-PCR 检测miR-19-3p 的表达情况,结果显示：miR-19a-3p 在胃癌组织中表达量高于正常胃组织。见图1。

图1 miR-19a-3p 在胃癌及正常胃组织中的表达情况

2.2 临床相关参数与miR-19a-3p 高表达的关系分析肿瘤最大径＞50 mm、年龄≥66 岁、男性、淋巴结有转移均不是影响miR-19a-3p 高表达的单因素,差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1,图2,图3。

图2 miR-19a-3p 表达情况与胃癌分级的关系(引用自UALCAN 数据库：http://ualcan.path.uab.edu//cgi-bin/ualcan-res-mir.pl)

图3 Kaplan-Meier 生存曲线(引用自http://kmplot.com/analysis/index.php? P=service&cancer=pancancer_mirna)

表1 临床相关参数与miR-19a-3p 高表达的关系分析(n)

2.3 PTEN 免疫组化染色结果 PTEN 免疫组化染色结果：阴性与背景色颜色一致,弱阳性时呈棕色,较背景色稍深,中阳呈中等棕褐色,强阳呈棕褐色。本实验PTEN 免疫组化染色结果提示：低分化胃癌明显呈弱阳或阴性,中-高分化胃癌及正常胃组织呈中阳或强阳性,提示胃癌分化程度越低,PTEN染色越呈阴性。见图4。

图4 PTEN 免疫组化染色

2.4 PTEN 免疫组化染色结果与miR-19a-3p 高表达的关系 在低分化胃癌中,miR-19a-3p 高表达且PTEN 免疫组化染色为阴性7 例,阳性2 例,miR-19a-3p 低表达且PTEN 免疫组化染色为阴性者0 例,阳性者4 例。结果显示：miR-19a-3p 在胃癌组织中高表达,而胃癌分化越差,PTEN 免疫组化染色越呈阴性。

3 讨论

随着医疗技术和医疗手段的迅速发展,胃癌的治疗效果及患者的生存质量有了很大的提高,血液中的肿瘤标记物的等指标有了明显降低［5］。通过本次实验发现,miR-19a-3p在胃癌组织中表达高于正常胃组织,但其表达量与临床相关参数无显著相关,因此并未得到miR-19a-3p 可能作为胃癌诊断的生物学标记物的可靠证据。

miRNA 在人体中广泛表达,参与癌症发展的多个进程［6］,是近年来的一大研究热点。多种研究表明,不同种类的miRNA 在胃癌中表达上调或下调,从而影响胃癌的疾病进程,如miR-214［7］,miR-301［8］,miR-1301［9］,miR-335［10］等。miRNA 也在多种肿瘤性及非肿瘤性疾病中起作用,如食管癌［11］,宫颈癌［12］,阿尔兹海默症［13］等。miRNA 作用广泛,可与其他种类非编码RNA 共同调节人体的生物学机能［14］。

PTEN 基因是人体内除了P53 以外存在最为广泛的抑癌基因,其活性的丧失可能与多种癌症的发生相关［15］。PTEN 基因与恶性肿瘤的预后及复发也有一定的相关性［16］。而miRNA 可通过多种机制,如PTEN/PI3K/AKT 通路或直接与PTEN 结合,从而使PTEN 基因上调或下调,进而抑制或促进恶性肿瘤的发生［17］。

由于2019年新冠疫情的爆发,给标本收集带来了一定的难度,致使本次实验收集的标本数量较少,地域相对集中,实验结果的个体差异性较大。对于miR-19a-3p 及PTEN 基因在胃癌中作用机制的研究并未得到明确的发现及证实,后续将进一步增加样本量,继续探讨miR-19a-3p 及PTEN 基因与胃癌的关系,以及二者联合作为诊断胃癌的分子标记物及治疗靶点的可能性。