褪黑素处理对采后李果实Priming 抗病性的诱导作用

雷长毅，汪开拓，谭美琳，王劲松，黎春红

（重庆三峡学院生物与食品工程学院，重庆 404000）

李（Prunus salicinaLindl.）为蔷薇科李属植物，其成熟果实的果色多样，口感酸甜多汁且富含诸多有益人体健康的生物活性化合物，如多酚类化合物、类胡萝卜素和抗坏血酸等，因此深受大众欢迎[1]。但李果实属于呼吸跃变型果实，且采摘期又逢高温季节（6～8 月），采后呼吸和乙烯释放速率高，果实在贮藏期间迅速软化，因此易受到病原菌侵染而加速果实腐烂，从而失去商业性，其中，匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）是主要的致病菌，极易引起李果实采后品质劣变，造成严重的经济损失[2]。以化学杀菌剂（如噻菌灵、仲丁胺、扑海因等）来控制李果实采后病害的效果极为显著，但化学残留及病原菌耐药性等问题严重限制了药剂保鲜的应用[3]。现阶段，众多绿色环保的化学激发子如水杨酸、茉莉酸及其甲酯衍生物、苯丙噻唑硫代乙酸甲酯（BTH）、β-氨基丁酸（BABA）、油菜素内酯等均被证实可有效诱导果蔬抗病性，降低病害发生率[4]。因此，采用激发子诱导果实采后抗性是替代化学杀菌剂的可能途径。诱导抗病性包括直接诱导作用和敏化（Priming）反应，Priming 反应是指植物经激发子处理后只有受到病原菌侵染时才展现出更快、更强的抗病性反应，包括抗病基因表达、植保素合成等，是一种低成本、高效的抗病防御机制[5]。

褪黑素（melatonin，MT）是动植物中广泛存在的一种吲哚胺类激素，可参与众多信号传导过程从而调控细胞抗逆性反应以及能量和物质代谢[6]。研究表明，采后MT 处理可显著抑制采后香蕉[7]和梨果实[8]中乙烯合成，并维持桃[9]、荔枝[10]、石榴[11]等果实活性氧代谢平衡，进而延缓这些果实在贮藏期间的品质劣变速度。此外，外源MT 还可诱导模式作物拟南芥和烟草中水杨酸和乙烯介导的一系列防御基因的表达，激活植株防卫反应[12]。但MT 处理对采后果实抗病性的具体诱导模式仍不明确。本研究以“凤凰”李果实为试材，通过研究MT 处理对李果实贮藏期间H2O2、抗性相关酶活性及苯丙烷类代谢的影响，分析MT 对李果实抗病性的诱导作用，为MT 处理在李果实实际保鲜中的推广提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

八分熟的“凤凰”李（Prunus salicinacv ‘Fenghuang’） 于2020 年6 月采自四川省遂宁市船山区仁里镇有机李种植基地，采摘后2 h 内运回实验室，先将有病虫害和机械伤的李果实去除，挑选转色均匀、大小一致的果实摊于实验台，经自然风散去田间热；匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）参考Li 等[13]的方法进行分离、纯化及鉴定，以传代培养后的菌丝体为材料，用无菌生理盐水缓慢冲洗出成熟根霉孢子，并将孢子浓度稀释为1.0×105个/mL（血球计数板），现配现用；褪黑素（MT）、几丁质、Follin 试剂、4-香豆酸 美国Sigma 公司；邻苯二酚、亚油酸钠、L-苯丙氨酸、N-乙酰葡萄糖胺、亚硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、愈创木酚 重庆拓世众和生物技术有限公司；3,5-二硝基水杨酸（DNS）、昆布多糖、对二甲氨基甲醛（DMAB） 上海源叶有限公司。

PAL-1 型数显折光仪 日本爱拓公司；DW-86L328 型超低温冰箱 浙江捷胜设备有限公司；HWS-P400C 恒温恒湿培养箱 合肥达斯卡特科技有限公司；UT-1900 型全波长分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 MT 处理浓度参考Bal[14]的实验结果进行确定。李果实以75%（v/v）乙醇溶液表面擦拭并晾干，随后用无菌解剖针在果实最大横截面处对称穿孔2 个（2 mm×2 mm），随后随机划分为4 份：对照组：用移液枪在李果实穿刺部位注入15 μL 无菌蒸馏水；MT 处理组：将10 μL 浓度为10 mmol/L 的MT溶液注入李果实穿刺部位；R.stolonifer接种组：每个穿刺部位注入15 μL 的1.0×105个/mL 的孢子悬浮液；MT+R.stolonifer处理组：先在李果实穿刺部位注入15 μL 10 mmol/L 的MT 溶液，于20 ℃放置6 h，随后在各穿刺处接种15 μL 的1.0×105个/mLR.stolonifer孢子悬浮液。以上处理完成后，用PE 塑料盒进行分装，每盒6 颗果实，每个处理组共15 盒，置于（20±1）℃、80 %～90% RH 条件下贮藏5 d。在此期间每天观察李果实根霉病的发病情况，同时取样用无菌手术刀切取健康果肉组织于液氮速冻再置于−80 ℃超低温冰箱中保存，用于后续指标测定。各处理均重复3 次，整个实验重复2 次。

1.2.2 发病率和病斑直径的测定 李果实病斑直径超过2 mm 时，则可认为是发病果；病果病斑直径用游标卡尺直接确定。

1.2.3 H2O2含量的测定 称取1 g 果实冻样，加入5 mL冷丙酮匀浆，匀浆液超声提取1 h 后于2 ℃，10000×g离心10 min。收集上清液根据Patterson 等[15]的方法测定H2O2含量，结果以nmol/g FW 表示。

1.2.4 细胞壁水解酶活性的测定 根据Abeles 等[16]的方法测定几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性，以每小时催化生成1 mg N-乙酰葡萄糖胺为1 个几丁质酶活单位，以每小时形成1 mg 葡萄糖为1 个β-1,3-葡聚糖酶活单位；以上酶活性结果均以U/g FW 表示。

1.2.5 苯丙烷类代谢途径关键酶活性的测定 根据Zucker[17]的方法测定苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性，每小时反应液在290 nm 处吸光度增加0.01 为1 个酶活力单位；根据范存斐等[18]的方法测定肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）和4-香豆酸辅酶A 连接酶（4-CL）活性，以每小时反应液在340 nm 处吸光度增加0.01为1 个C4H 酶活性单位，以每分钟反应液在333 nm处吸光度增加0.01 为1 个4-CL 酶活性单位；根据Cao 等[19]的方法测定过氧化物酶（POD）活性，以每分钟酶促反应体系在470 nm 处吸光度增加0.01 为1 个酶活性单位；以上酶活性结果均以U/g FW 表示。

1.2.6 总酚及木质素含量的测定 根据Flion-Ciocalteu 法[20]测定总酚含量；木质素含量则参照Wang等[21]的方法进行测定。总酚和木质素含量结果均以mg/g FW 表示。

1.2.7 脂氧合酶（LOX）和多酚氧化酶（PPO）活性的测定 根据Lin 等[22]的方法测定LOX 活性，略有修改；用4 ℃预冷的磷酸缓冲液（0.1 mol/L、pH6.8）冰浴提取LOX 粗酶液。取2.75 mL 0.1 mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液、0.05 mL 浓度为0.1 mol/L 的亚油酸钠溶液，在30 ℃保温10 min 后加入0.2 mL 粗酶液混匀，以反应液每分钟在234 nm 处吸光度增加0.01 为1 个LOX 活性单位；根据Cao 等[19]的方法测定PPO 活性，以每分钟酶促反应体系420 nm 处吸光度增加0.01 为1 个酶活性单位；以上酶活性结果均以U/g FW 表示。

1.3 数据处理

除果实根霉病发病率和病斑直径重复测定5 次外，其余各指标均重复测定3 次。绘图采用Excel 2010，差异显著性检验采用SPSS26.0（Duncan 多重比较法），其中显著水平设定为5%。

2 结果与分析

2.1 MT 处理和R.stolonifer 接种对采后李果实根霉病的影响

对照组和MT 处理组李果实的表观无明显变化，未见明显的发病果实；李果实接种R.stolonifer后发病率不断上升，同时病斑直径也急剧增加。贮藏5 d 后，MT+R.stolonifer接种组的果实发病率为55.35%，病斑直径为14.31 mm，较只接种R.stolonifer的果实分别下降了36.24%和45.65%，说明MT 处理能够有效控制李果实采后病害的发生（图1A、B）。

图1 MT 处理和R.stolonifer 接种对采后李果实发病率（A）和病斑直径（B）的影响Fig.1 Effects of MT treatment and R.stolonifer inoculation on disease incidence（A）and lesion diameter（B）in postharvest plums

2.2 MT 处理和R.stolonifer 接种对采后李果实H2O2含量的影响

如图2 所示，对照李果实在20 ℃贮藏期间H2O2含量呈缓慢上升趋势。单一MT 处理组与对照组之间的H2O2含量无显著差异（P＞0.05），而接种R.stolonifer的李果实H2O2含量大幅上升，并在贮藏第1 d 达峰值，随后不断下降，由于果蔬在受到病原菌侵染时会产生应激反应，H2O2迸发是典型的应激反应，所以在接种后会大量生成。与单一接种R.stolonifer的果实相比，MT+R.stolonifer接种则更为显著（P＜0.05）的诱导了李果实中H2O2的生成，其含量峰值较单一接种组上升了31.90%。

图2 MT 处理和R.stolonifer 接种对采后李果实H2O2 含量的影响Fig.2 Effects of MT treatment and R.stolonifer inoculation on H2O2 content in postharvest plums

2.3 MT 处理和R.stolonifer 接种对采后李果实细胞壁水解酶活性的影响

如图3 所示，对照李果实中几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性在整个贮藏期间保持稳定。经单一MT 处理的果实中几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性在贮藏期间逐渐上升，在贮藏3 d 后其活性显著（P＜0.05）高于对照组水平；接种R.stolonifer后，几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性迅速上升，并在第1 d达到峰值水平，随后呈逐渐下降趋势，因为几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶对病原菌有抑制作用，是植物中典型的抗病相关酶，所以当葡萄果实遭受病原菌侵染时，其活性被立即诱导。MT+R.stolonifer接种处理可明显诱导两种酶在整个贮藏期间保持较高活性，其活性值在各取样点均显著（P＜0.05）高于单一接种R.stolonifer果实。

图3 MT 处理和R.stolonifer 接种对采后李果实几丁质酶（A）、β-1,3-葡聚糖酶（B）活性的影响Fig.3 Effects of MT treatment and R.stolonifer inoculation on the activities of chitinase (A) and β-1,3-glucanase (B) in postharvest plums

2.4 MT 处理和R.stolonifer 接种对采后李果实苯丙烷类代谢途径关键酶活性的影响

如图4 所示，在贮藏期间，对照组李果实中PAL 和4-CL 的活性基本维持稳定，C4H 和POD 活性则缓慢上升。MT 处理可有效提高上述苯丙烷类代谢途径关键酶活性。李果实接种R.stolonifer后，PAL、C4H、4-CL 和POD 活性迅速上升；MT+R.stolonifer接种处理可更为显著诱导李果实中PAL、C4H、4-CL 和POD 活性的上升，使酶活性在整个贮藏期间均显著（P＜0.05）高于单一接种处理水平。

图4 MT 处理和R.stolonifer 接种对采后李果实PAL（A）、C4H（B）、4-CL（C）和POD（D）活性的影响Fig.4 Effects of MT treatment and R.stolonifer inoculation on the activities of PAL (A),C4H (B),4-CL (C) and POD (D) in postharvest plums

2.5 MT 处理和R.stolonifer 接种对采后李果实总酚及木质素含量的影响

如图5 所示，对照组李果实在20 ℃贮藏过程中，其总酚和木质素含量在第1 d 达峰值，随后逐渐降低。MT 处理有效促进了李果实总酚和木质素含量的积累，使两者含量在贮藏期间显著（P＜0.05）高于对照水平。R.stolonifer接种显著提高了李果实总酚和木质素的含量，但经MT+R.stolonifer接种处理的果实中总酚及木质素含量在整个贮藏期间均显著（P＜0.05）高于单一接种组水平。

图5 MT 处理和R.stolonifer 接种对采后李果实总酚（A）和木质素（B）含量的影响Fig.5 Effects of MT treatment and R.stolonifer inoculation on total phenolic (A) and lignin (B) content in postharvest plums

2.6 MT 处理和R.stolonifer 接种对采后李果实LOX和PPO 活性的影响

如图6 所示，采后贮藏期间，对照组李果实中LOX 活性随贮藏时间的延长而缓慢上升，同时PPO活性基本维持稳定。单一MT 处理组李果实中LOX活性在贮藏期间缓慢上升，PPO 活性保持稳定。R.stolonifer接种显著（P＜0.05）诱导李果实LOX 和PPO 活性水平的上升；而与单一R.stolonifer接种组相比，MT+R.stolonifer接种处理可更显著（P＜0.05）提升李果实贮藏期间这两种酶的活性水平，使其保持在较高水平。

图6 MT 处理和R.stolonifer 接种对采后李果实LOX（A）和PPO（B）活性的影响Fig.6 Effects of MT treatment and R.stolonifer inoculation on the activities of LOX (A) and PPO (B) in postharvest plums

3 讨论

MT 为植物内源吲哚类激素，其通过信号传导作用参与植物的众多抗逆反应[23]。外源MT 处理可有效延缓番茄[24]、水蜜桃[9]、樱桃[25]和草莓[26]等多种果实的采后衰老进程，维持果实综合品质。在本研究中，10 mmol/L MT 处理可有效诱导李果实中活性氧迸发、提高抗病相关酶活性并促进总酚和木质素的合成，从而抑制采后贮藏期间果实根霉病的发生，维持果实的综合品质。

根据植物诱导抗性理论，抗病性的表达是一种典型植物应激反应，可调动组织和细胞内的底物和能量从正常的代谢途径转入病程相关基因（pathogenesis-relatedgenes，PRs）的表达和抑菌物质的合成，因此可能限制植物的生长和发育；priming 反应是植物免疫系统的共同特征，也是植物诱导抗病性的重要细胞机制，是一种基于代谢平衡和防卫反应的植物抗性模式，可显著减少植物的适应度损失[27]。研究表明，多种物理、化学和生物等激发子在低浓度状态下使用时，均可有效诱导果实的priming 反应，从而使果实在受到病原菌严重侵染时表达强烈抗性。团队前期研究也证明，BABA（10～50 mmol/L）、BTH（0.1 mmol/L）和茉莉酸甲酯（10 μmol/L）等激发子均可通过诱导杨梅[21]、草莓[28]和葡萄[29]等果实的priming 反应，来提升果实采后抗性，同时也促进了可溶性糖的积累。此外，H2O2迸发是植物受到病原微生物侵染的典型应激反应，其充当信号分子启动植物超敏反应，从而提升果实抗性反应[30]；几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶为植物重要的细胞壁水解酶，其可特异性水解真菌细胞壁，阻碍病原菌的进一步侵染[16]；植物苯丙烷类代谢途径是合成酚类和木质素等抗菌物质的主要途径，PAL、4-CL、C4H 和POD 是该途径的关键酶类[31]。LOX 不仅参与调节植物的生长发育、成熟衰老等过程，在乙烯介导的抗病反应中也起着重要的调控作用[22]。在本研究中，经单一10 mmol/L MT 处理的李果实中苯丙烷类代谢酶以及总酚和木质素含量在整个贮藏期间均高于对照果实，但MT处理对抗病相关酶的诱导作用有限；当经MT 处理的果实再接种R.stolonifer后，果实内H2O2含量、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖活性以及苯丙烷类代谢酶（PAL、4-CL、C4H 和POD）活性、木质素和总酚含量在贮藏第1 d均出现明显峰值，并在整个贮藏期间均显著高于单一接种水平。这些结果说明，MT 处理诱导的李果实抗病反应可归为priming 反应类型，即单一MT 处理可使果实处于防御准备（primed）状态，随后病原菌侵染时则迅速激活并放大防卫反应，阻止病原菌的进一步侵染，从而降低腐烂率并缩小病斑直径。此外，MT+R.stolonifer处理也能显著诱导LOX活性的上升，暗示MT 诱导的李果实priming 反应可能是由乙烯介导的ISR（induced systemic resistance，诱导系统抗性）类型。与本研究相类似，众多根瘤菌也可通过乙烯或茉莉酸途径诱导植物的priming 反应[32]。但同时，MT 也可通过水杨酸（SA）途径诱导采后草莓果实SAR（systemic acquired resistance，系统获得性抗性）反应从而提高抗病性[26]。因此，MT 调控不同信号传导路径防卫反应的相关分子机理有待进一步阐明。

4 结论

a.10 mmol/ L MT 可有效诱导采后李果实抗病相关酶活性以及总酚和木质素含量的提高，从而提升抗病性，减少采后贮藏期间根霉病的发生。

b.经MT 诱导的李果实在遭受病原菌侵染时可展现出强烈的活性氧迸发、较高的抗病相关酶活性及抗病相关物质含量增加，暗示该防卫反应归因于一种典型的priming 反应机制。