α-葡聚糖酶在甜菜制糖中的试验研究

张菡 ，吴子毅 ，赵抒娜 ，，陈海军 ，3，杨钊 ，3，王宝 ，

（1.中粮屯河糖业股份有限公司/农业部糖料与番茄质量安全控制重点实验室，新疆昌吉831100；2.中粮营养健康研究院有限公司/老年营养食品研究北京市工程实验室，北京 102209；3.中粮屯河崇左糖业有限公司，广西崇左 200040）

0 引言

在制糖过程中，甜菜原料若受到压伤、冻伤、病虫危害，或者收后长时间放置，均会感染肠膜明串珠菌、链球菌属等微生物，微生物分泌出的葡聚糖蔗糖酶能够催化蔗糖生成葡萄糖，葡萄糖则进一步聚合形成葡聚糖（又称右旋糖酐）。葡聚糖是一种高分子量的多糖聚合物，主要由α-（1→6）糖苷键连接，但亦有少量的α-（1→4）、α-（1→3）、α-（1→2）糖苷键。 葡聚糖分子量从一万到几百万不等，根据其大小，可将葡聚糖分为高分子量葡聚糖（＞1 000 kDa）、中分子量葡聚糖（100～1 000 kDa）及小分子量葡聚糖（＜100 kDa）[1]。

葡聚糖含量高时，会对制糖过程产生以下危害：1）降低过滤速度，影响清净效率，增加糖汁粘度；2）结晶过程中造成糖蜜粘度增高，影响蔗糖分的结晶率，使煮糖时间及洗蜜时间延长，增加耗汽量，降低设备利用率；3）导致蔗糖结晶异型，C轴扁长，形成易碎的扁状晶，在分蜜过程中易断裂，穿过筛网造成损失；同时，这种晶型也会影响洗蜜，造成打水量增多，增加废蜜量，给制糖生产带来更大的糖分损失[2-5]。

就如何避免或消除葡聚糖对制糖工业的负面影响，国内甜菜制糖产业采取了一系列措施，如做好甜菜原料保藏及生产车间卫生管理，使用杀菌剂以减少葡聚糖的产生等。但在葡聚糖已经产生并影响正常生产的情况下，最有效的处理方法就是加入α-葡聚糖酶，将葡聚糖降解成小分子糖类[6]。据报告，美国、日本、南非、澳大利亚、印度等国自20世纪60年代就已开始研究α-葡聚糖酶在制糖中的应用技术[2，7-9]。国内广州甘蔗糖业研究所成功开发出葡聚糖浓度快速测定技术，并将α-葡聚糖酶应用在甘蔗制糖生产中[10-12]。陆海勤等[13]使用细丽毛壳菌生产α-葡聚糖酶，并用于甘蔗制糖小试实验，结果表明α-葡聚糖酶可有效提高过滤和沉降速度、降低清汁浑浊度和色值。目前，就α-葡聚糖酶在甜菜制糖中的应用及效果评估，国内外相关研究较少。

本文针对α-葡聚糖酶在甜菜制糖过程中的使用条件开展了一系列研究工作，为α-葡聚糖酶在甜菜制糖生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

葡聚糖标准品T-2000购自上海源叶生物科技有限公司；α-葡聚糖酶（活性30 000 U/mL）购自阿玛诺天野酶制剂商贸（上海）有限公司；右旋糖酐单克隆抗体免疫比浊检测试剂盒购自广州甘蔗糖业研究所研制；氯化钠、氯化钾、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、盐酸、氢氧化钠、三氯乙酸、无水乙醇、无水甲醇、铁氰化钾、七水合硫酸锌等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与耗材

浊度计：MCA-Sucrose TM，美国Midland公司；电热恒温水浴锅：DK-S24型，上海森信实验仪器有限公司；电子分析天平：ME204E，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；电热鼓风干燥箱：DHG-9240，上海一恒科学仪器有限公司；加热磁力搅拌器：RCT，德国IKA公司；紫外可见分光光度计：UV-2800型，尤尼柯（上海）仪器有限公司；水分测定仪：HC103型，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；高压蒸汽灭菌锅：YX-280A，上海三申医疗器械有限公司；台式数显pH计：PHS-25，上海雷磁；手持锤度计：MASTER-53a，ATAGO日本爱拓；移液枪：5 mL、1 000 μL、20 μL，德国 Eppendorf；微孔有机滤膜：0.45 μm，美国安捷伦。

1.3 试验方法

1.3.1 试剂的配制

标准葡聚糖溶液的制备：将葡聚糖放于105℃干燥箱内干燥至恒重，取出放入干燥器内并冷却至室温，得到无水葡聚糖；通过将无水葡聚糖与一定比例的蒸馏水进行混合，配制得到不同浓度的葡聚糖标准溶液。

抗体稀释液 PBS 的配制：称取 8.00 g NaCl、0.20 g KCl、3.63 g Na2HPO4·12H2O、0.24 g KH2PO4，溶于 900 mL蒸馏水中，用盐酸调节至pH值7.2，加水定容至1 L，常温保存备用。

抗体溶液的配制：取一盒葡聚糖单克隆抗体，加入13 mL抗体稀释液，充分摇匀溶解，静置15 min备用。量取1mL配制好的抗体溶液在浊度计上读数，若读数大于40 NTU，则必须用0.45 μm滤膜进行过滤。抗体溶液在室温（25℃）下可保存12 h，当天配制当天使用。

1.3.2 样品制备

甜菜浸出汁取自中粮屯河糖业股份有限公司昌吉糖业分公司，其锤度为14.2%，糖度为12.6%，纯度为88.6%，pH值为6.2。

不含葡聚糖的浸出汁制备方法：取浸出汁放置于恒温水浴锅中，在60℃下预热15 min，加入过量的α-葡聚糖酶稀释液（添加比例50 mg酶/kg浸出汁）反应30 min，在该条件下，浸出汁中的葡聚糖可全部除去。反应结束后，将浸出汁煮沸40 min进行灭酶。

1.4 葡聚糖浓度的测定

1.4.1 标准溶液测定

采用免疫分析法测定葡聚糖的含量。首先，配制浓度一定的葡聚糖标准溶液。测定时，将1.0 mL抗体溶液加入测试皿中，置浊度计中每5 s读取一次浊度值，直到读数稳定不再下降（间隔10 s的两次读数相同），记录该浊度值作为空白浊度值。然后，加入10 μL葡聚糖标准液，用移液枪反复吹打6次（避免产生气泡），每5 s读取浊度值，浊度值会产生先升后降的变化，取最高值为标准溶液的浊度值；标准溶液浊度值与空白值的示数之差记为△NTU标，即△NTU标=标准溶液浊度值-空白浊度值。

1.4.2 样品测定

将1.0 mL抗体溶液加入测试皿中，每5 s读取浊度值，直至读数稳定不再下降，记录该浊度值作为空白值。加入10 μL待测样液，用移液枪反复吹打6次，置浊度计中每5 s读取浊度值，取最高值为待测样品溶液的浊度值，两次浊度值示数之差记为△NTU样，即△NTU样=样品溶液浊度值-空白浊度值。

1.4.3 样品中葡聚糖浓度计算

C样=C标×ΔNTU样/ΔNTU标（C样为样品中的葡聚糖浓度；C标为标准溶液的葡聚糖浓度）

1.4.4 葡聚糖去除率测定

葡聚糖去除率（%）=（1-酶解反应后浸出汁中的葡聚糖浓度/加酶前浸出汁中的葡聚糖浓度）×100%

2 结果与分析

2.1 免疫分析法验证

葡聚糖含量的常用测定方法包括酒精Haze法、Amstar契约法、SPRI法等，这类方法是利用葡聚糖在酒精中发生沉淀产生浑浊，在一定范围内葡聚糖浓度与溶液浑浊度呈正比关系，从而可测定葡聚糖含量。此外，葡聚糖检测方法还包括Robert铜法和酶水解法，前者是利用葡聚糖与苯酚发生显色反应测定葡聚糖含量，后者则是使用葡聚糖水解酶将葡聚糖水解成葡萄糖，再通过测定葡萄糖含量推算出葡聚糖含量[14]。

本研究所使用的免疫分析法是一种较为新型的葡聚糖含量检测方法，其原理是待测样品中的葡聚糖（抗原）与其抗体会发生特异性结合，形成络合物并产生浊度；在抗体过量的情况下，则络合物形成的浊度与葡聚糖的含量成正比，将待测样品引起的浊度变化值与标准品引起的浊度变化值进行对比，则可计算得到待测样品中的葡聚糖浓度[15-16]。与常用的Haze法相比较，免疫分析法具有操作简单、准确度高的特点。根据课题组对酒精Haze法与免疫分析法的使用经验，因甜菜制糖中间汁制品所含各类杂质较多，且酒精Haze法检测所需样品量较大，因此造成该方法的准确性较差；而免疫分析法不需要从样品中预分离出葡聚糖，每次检测仅需10 μL样品量，中间汁杂质成分对浊度的影响可忽略不计，因此可获得快速、准确的检测结果。

表1 免疫分析法加标回收率试验结果Table 1 Results of immunoassay adding standard substance recovery test

为验证免疫分析法的准确性，采用加标回收的方法，对100 mg/kg的葡聚糖标准液做加标回收试验，即将1 g/kg葡聚糖标准液加入100 mg/kg葡聚糖标液中，使其浓度范围达到100～500 mg/kg，采用免疫分析法测定浊度；以100 mg/kg的葡聚糖标准液为基准计算加标回收率，结果如表1所示。

由表1可知，免疫分析法测定葡聚糖的加标回收率在93.89%～106.67%之间，平均加标回收率为99.48%，准确性较好。

2.2 α-葡聚糖酶处理甜菜制糖浸出汁的作用条件研究

2.2.1 pH值对降解作用的影响

取不含葡聚糖的浸出汁，加入葡聚糖浓度为20 g/kg的标准溶液，配制葡聚糖浓度为500 mg/kg的浸出汁溶液，分别装入 5 个 100 mL 的烧杯中，并调节 pH 值至 5.0±0.1、6.0±0.1、7.0±0.1、8.0±0.1、9.0±0.1。 将浸出汁转移至比色管，放置于60℃恒温水浴中预热15 min，分别加入浓度为5 mg/kg的α-葡聚糖酶，摇均反应5 min，反应完毕后煮沸20 min灭酶，冷却至室温并测定葡聚糖浓度，结果见图1。

图1 pH值对酶解作用的影响Fig.1 Effect of pH on enzymatic hydrolysis

图2 α-葡聚糖酶浓度对酶解作用的影响Fig.2 Effect of α-glucanase concentration on enzymatic hydrolysis

由图1可知，在初始葡聚糖浓度500 mg/kg、α-葡聚糖酶浓度5 mg/kg、反应温度60℃、反应时间为5 min时，在pH值为5.0～9.0的范围内，α-葡聚糖酶均有一定的酶解性能；尤其当pH值为5.0～7.0时，其对葡聚糖的去除效果最好，去除率达到了80%以上。随着pH值的进一步升高，葡聚糖去除率大幅下降；当pH值达到8.0时，葡聚糖的去除率为60.03%；当pH值达到9.0时，α-葡聚糖酶已基本失去活性，去除率不足20%。综上所述，5.0～7.0为α-葡聚糖酶的最适pH值范围，加酶工段的操作pH值应尽可能保持在8.0以下。另据Jiménez以及吴兆鹏等的研究，α-葡聚糖酶在pH值5.0左右时活性最高，与本文的研究结果一致[17-18]。

2.2.2 葡聚糖酶浓度对酶解作用的影响

配制葡聚糖浓度为500 mg/kg的浸出汁溶液，调节pH值至5.0，分别装入5个50 mL的比色管。将比色管放置于60℃恒温水浴中预热15 min，分别加入浓度为0 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg的葡聚糖酶并反应5 min，冷却至室温并测定葡聚糖浓度，结果如图2所示。

由图2可知，当葡聚糖浓度为500 mg/kg、反应温度为60℃、反应pH值为5.0、反应时间为5 min时，随着α-葡聚糖酶浓度的增大，反应后的葡聚糖量逐渐减低，葡聚糖的去除率逐渐增大。当α-葡聚糖酶的浓度为1 mg/kg时，葡聚糖的去除率达到68.35%，说明α-葡聚糖酶的作用效果明显。当α-葡聚糖酶为3 mg/kg以上时，去除率的增加趋势明显变缓；当葡聚糖酶浓度为5 mg/kg时，葡聚糖的去除率为93.85%；进一步增大α-葡聚糖酶浓度至10 mg/kg，葡聚糖去除率增加至96.98%，增幅较小。鉴于酶制剂价格较高，在甜菜制糖工业应用中，选择2～5 mg/kg的α-葡聚糖酶浓度较为合适。

2.2.3 葡聚糖浓度对降解作用的影响

分别配制葡聚糖浓度为100 mg/kg、300 mg/kg、500 mg/kg、700 mg/kg、1 g/kg的浸出汁溶液，调节pH值至5.0，放置于60℃恒温水浴中预热15min，加入浓度为5 mg/kg的α-葡聚糖酶并反应5min，结果如图3所示。由图3可知，在α-葡聚糖酶浓度为5 mg/kg、反应温度为60℃、反应pH值为5.0、反应时间为5 min的条件下，初始葡聚糖浓度从100 mg/kg增加至1 g/kg时，葡聚糖的去除率均达到90%以上。例如，当初始葡聚糖浓度为300 mg/kg时，经酶制剂的降解作用，其含量下降至13 mg/kg；当初始葡聚糖浓度为700 mg/kg时，经酶制剂的降解作用，其含量下降至46 mg/kg。根据工厂的实际经验，甜菜制糖过程中葡聚糖的浓度通常在1 g/kg以下，因此5 mg/kg的添加量足够保证去除效果。

图3 葡聚糖浓度对降解作用的影响Fig.3 Effect of dextran concentration on degradation

图4 温度对降解作用的影响Fig.4 Effect of temperature on degradation

2.2.4 温度对葡聚糖酶降解作用的影响

配置得到葡聚糖浓度为500 mg/kg、pH值为5的浸出汁溶液，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下预热15 min，加入浓度为5 mg/kg的α-葡聚糖酶并反应5 min，结果如图4所示。由图4可知，当葡聚糖浓度为500 mg/kg、α-葡聚糖酶浓度为5 mg/kg、pH值为5.0、反应时间为5 min时，在40～70℃的温度范围内，α-葡聚糖酶均有一定的酶解性能；在50～60℃时作用效果最好，葡聚糖去除率达到93%以上。随着温度的进一步升高，葡聚糖去除率大幅下降，当温度达到70℃时，葡聚糖去除率为51.30%；当温度达到80℃时，α-葡聚糖酶已基本失去活性，去除率不足5%。综上所述，50～60℃为α-葡聚糖酶的最适反应温度，加酶工段的操作温度应尽可能控制在70℃以下。据岑成福等的研究，葡聚糖酶在40～60℃范围内均保持较高活性，对蔗汁中的葡聚糖去除率达到75%以上[19]；另据Jiménez报道，真菌葡聚糖酶在温度为50℃时活性最高[17]。上述报道与本文的研究结论一致。

2.2.5 反应时间对降解作用的影响

配制得到葡聚糖浓度为500 mg/kg、pH值为5的浸出汁溶液，在60℃条件下预热15 min，加入浓度为5 mg/kg的α-葡聚糖酶，并分别反应 1 min、3 min、5 min、7 min、10 min，结果如图5所示。由图5可知，在初始葡聚糖浓度为500 mg/kg、α-葡聚糖酶浓度为5 mg/kg、反应温度为60℃、pH值为5.0的条件下，随着反应时间的延长，葡聚糖浓度逐渐减低，葡聚糖的去除率逐渐增大，而变化趋势则逐渐放缓。当反应时间为1 min时，葡聚糖的去除率达到75.87%；当反应时间达到5 min时，葡聚糖的去除率达到93.85%；当反应时间继续延长时，去除率增加缓慢，这一点与岑成福等的研究一致[19]。

理论上，反应时间的延长有利于α-葡聚糖酶的降解作用，但在实际生产过程中，因浸出汁呈酸性，停留时间过长会加大蔗糖的转化，不利于白砂糖质量和产量的提高。在甜菜制糖生产中，葡聚糖酶的添加位点通常位于浸出汁出口处；浸出汁通过管路输送至预灰工段，pH值会快速上升至11.0左右，造成葡聚糖酶的灭活。在甜菜糖厂，浸出汁从浸出器出口流送至预灰槽的时间通常在5 min左右；为延长酶的作用时间，也可以在浸出器与预灰槽之间增加缓冲罐。综合考虑，酶的作用时间以5～10 min较为合理。

图5 反应时间对降解作用的影响Fig.5 Effect of reaction time on degradation

3 结论与讨论

通过本研究可知，使用免疫分析法测定甜菜浸出汁的葡聚糖浓度，具有准确性高、较为快捷的优点。通过研究α-葡聚糖酶对浸出汁的作用条件，得出α-葡聚糖酶的最适浓度为5 mg/kg，最适反应温度为50～60℃，合理作用时间为5～10 min，最优pH值范围为5.0～7.0。甜菜原料的葡聚糖浓度和气候变化有密切关系，在气温偏高、波动较大的情况下，易导致甜菜反复冻融，加速微生物滋生，并造成葡聚糖浓度上升。2016/2017榨季后期，因新疆伊犁地区气候异常，导致当地多家甜菜糖厂出现原料葡聚糖浓度升高、中间汁过滤困难的问题；通过α-葡聚糖酶的应用，有效解决了工厂的生产难题，保障了低品质甜菜的正常加工。

目前，国内外对葡聚糖酶在甜菜制糖中的研究报道较少，在甘蔗制糖中则有一些应用研究。例如，根据岑成福等的研究，α-葡聚糖酶在酶剂量为0.05 U/mL蔗汁、pH值5.3、反应时间15 min、反应温度51℃的条件下，可将蔗汁中的α-葡聚糖（含量800～900 mg/kg）完全除去[19]。本研究中，在α-葡聚糖酶添加量5 mg/kg（按葡聚糖酶活性为30 000 U/mL计，对应酶剂量0.15 U/mL浸出汁）、pH值5.0、反应时间5 min的作用条件下，可将浸出汁中的α-葡聚糖（含量100 mg/kg～1 g/kg）除去90%以上。在甜菜制糖实际生产过程中，综合考虑葡聚糖问题的严重程度以及成本等因素，葡聚糖酶添加量通常控制在2～5 mg/kg（对应酶剂量0.06～0.15 U/mL）。总体而言，尽管甜菜浸出汁和蔗汁在非糖成分上有一些差异，但葡聚糖酶在甜菜制糖和甘蔗制糖中的最优使用条件是基本一致的。

下一步，课题组将在试验研究的基础上，进一步收集α-葡聚糖酶在甜菜制糖生产中的产业应用数据，详细评估葡聚糖酶的工厂使用效果及经济性。