昆虫几丁质酶功能研究、酶学性质及应用研究进展

李 妍 李家磊 师献雪 张俊丽 胡 淼

（新乡医学院三全学院，河南 新乡453000）

0 引言

几丁质是由多个N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）经由β-1，4糖苷键相互连接而成的一种长链多聚物，是目前世界上含量仅次于纤维素的生物聚合物[1]。主要有以下三种类型的存在，分别为α-几丁质、β-几丁质和γ-几丁质，在其组装和极化方面各有差异[2]。几丁质是具有保护功能的，存在于真菌的细胞壁、线虫的卵壳及昆虫的外骨骼、肠道、围食膜和气管等[3，4]。

几丁质的合成和降解是昆虫整个生命周期中重要的生理过程，其中几丁质的降解是由β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶和几丁质酶协同完成[5]。在昆虫生长发育过程中几丁质酶主要参与了其新旧表皮的更替，特别是在幼虫蜕皮、胚后细胞发育、化蛹阶段和羽化阶段[6]。如果在昆虫生长发育期间出现几丁质酶的过量表达或严重缺失，都会严重影响昆虫的正常生长发育，所以几丁质酶可以应用到害虫的防治方面，对人类和环境来说是安全有效的生物防治方法和策略[7]。

1.1 昆虫几丁质酶的生理功能

昆虫几丁质酶可广泛存在于昆虫的各个器官或组织当中，贯穿昆虫的整个生命周期，其主要存在于蜕皮腺、中肠中，参与昆虫新旧表皮的更替。昆虫蜕皮是昆虫发育变态过程中的重要生命过程，在这一过程中相关酶类的表达也发生重大变化。几丁质与表皮蛋白为结合状态，因此几丁质的代谢也是昆虫蜕皮过程的重要组成部分。在体壁中表达的几丁质酶主要与昆虫蜕皮和卵的孵化相关。中肠的几丁质酶可以消化围食膜（PM）、肠壁和外骨骼中的几丁质，表明几丁质酶具有应用到昆虫防治方面的潜力。

1.2 昆虫几丁质酶的分类及功能研究

在昆虫几丁质酶的分类当中，昆虫几丁质酶大多数属18家族糖苷水解酶，其余少数几丁质酶属48家族糖苷水解酶[8]，根据几丁质酶作用位点不同分为外切几丁质酶和内切几丁质酶两大类[9]，且昆虫几丁质酶多数是内切酶，可将昆虫表皮分解为壳寡糖，然后再由外切酶进行水解而生成β-N-乙酰葡萄糖胺，在昆虫生长发育中形成新的表皮[1]。

近年来，随着基因组学和序列分析测序工作的快速发展，广泛利用生物信息学和基因系统进化树等先进技术和新方法深入分析昆虫几丁质酶基因，越来越多的昆虫几丁质酶基因得到广泛认可，如鳞翅目昆虫、双翅目昆虫、膜翅目和半翅目等都有文献相继报道。

RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）是内源或外源的双链RNA特异性引起靶基因转录后沉默的现象。因其特异性和稳定性，目前被广泛应用到昆虫基因功能的研究当中。

根据昆虫几丁质酶催化区蛋白氨基酸序列结构进行分类，分为8种类型：Ⅰ型几丁质酶包含1个信号肽区（signal peptide）、1个催化区（Catalyticdomain）、1个糖基化和磷酸化连接区（linker）和1个几丁质酶结合区（chitin-binding domain，CBD）。RNA干扰沉默赤拟谷盗Ⅰ（Tribolium castaneum）几丁质酶基因TcCHT5（GroupⅠ）导致赤拟谷盗不能蜕去其表面的外壳，褐飞虱（Nilaparvata lugens）中NICht5导致幼虫死亡和蜕皮异常；在果蝇中DmCht5导致幼虫蜕皮异常[11]。RNAi试验结果表明Ⅰ型几丁质酶的作用主要是昆虫化蛹后水解消化旧的表皮。

Ⅱ型几丁质酶氨基酸序列明显比Ⅰ型大，在各物种中有一个代表基因就是CHT10，包含了至少4个催化结构域和4～7个几丁质酶结合区。RNA干扰赤拟谷盗中TcCht1的虫体无明显表型[11]；在褐飞虱中NICht1则导致幼虫死亡和蜕皮异常，沉默NICht3则无明显形态和存活率改变；在二化螟（Chilo suppressalis）中CsCht1则影响幼虫化蛹、羽化延迟，沉默CsCht3则导致幼虫不能化蛹[12]；在中华稻蝗（Oxya chinensis）中沉默OcCht10导致中华稻蝗无法完成蜕皮而死亡[13]；赤拟谷盗中沉默TcCHT10导致幼虫的蜕皮及化蛹异常；在褐飞虱中沉默NICht10导致幼虫死亡和蜕皮异常[14]；飞蝗（Locusta migratoria）LmCht10导致飞蝗无法蜕皮而死亡；舞毒蛾（Lymantria dispar）LdCht10导致虫体无法蜕皮而死亡[15]。

Ⅲ型几丁质酶是由一个N端跨膜螺旋、两个相邻的催化区和一个几丁质酶结合区构成，推测是昆虫化蛹后腹部收缩和翼/鞘扩张所必需的。RNA干扰赤拟谷盗中TcCht7则影响翅的发育；在褐飞虱中NICht7中导致幼虫死亡和蜕皮异常；在赤拟谷盗中TcCht7则影响翅的发育；在果蝇中DmCht7导致幼虫蜕皮异常[16]。

Ⅳ型几丁质酶是由1个N端信号肽区和1个单一的催化区组成的，大多数缺乏CBD，在大多数昆虫中，主要在幼虫时期表达。在褐飞虱中NICht4、NICht6无明显形态和存活率改变；在二化螟中CsCht4则导致幼虫死亡[12]；赤拟谷盗的TcCHT6虫体无表型改变；在果蝇中DmCht6影响蜕皮及干扰成虫正常的机翼伸展；褐飞虱NICht8无明显形态和存活率改变；赤拟谷盗的TcCHT8则虫体无表型改变；褐飞虱NICht9导致幼虫死亡和蜕皮异常；在果蝇中，RNA干扰DmCht9导致了蜕皮异常死亡，DmCht8导致幼虫蜕皮异常[16]。

Ⅴ型几丁质酶属于几丁质酶类似蛋白，通常有1个催化结构域和1个N端信号肽区，没有CBD区，如成虫盘生长因子（IDGFs）推测它可能参与调节细胞的增值与分化。

Ⅵ型昆虫几丁质酶与Ⅰ型几丁质酶具有类似结构，一个信号肽、一个催化区和一个CBD，但是与Ⅰ型不同的是，Ⅵ型几丁质酶C-端CBD后含有一个丝氨酸/苏氨酸残基富含区域高度糖基化修饰，推测有抗蛋白酶功能。

Ⅶ型昆虫几丁质酶包含一个催化区和一个N端信号肽，无CBD。RNAi实验中，在褐飞虱中NICht2无明显形态和存活率的改变；在二化螟中CsCht2则导致幼虫死亡；在果蝇中DmCht2蜕皮异常。在不同昆虫中，表现出不同的功能，具体原因需进一步研究。

Ⅷ型昆虫几丁质酶有一个跨膜区和一个催化结构域，推测为膜相关蛋白。

综上所述，通过注射特异的双链RNA，致使几丁质酶基因沉默，在不同的昆虫当中，相同类型的几丁质酶，产生的效应和表型也存在差别。但几丁质酶Cht10基因，在多数昆虫中如褐飞虱、赤拟谷盗、飞蝗和舞毒蛾中都影响了幼虫的蜕皮而致其死亡。

2 昆虫几丁质酶的酶学性质

2.1 昆虫几丁质酶的基本性质

昆虫几丁质酶的分子量多数在40～85 kDa，酶活性的最适pH值一般在4～8之间，最适反应温度在40～60℃，几丁质酶的热稳定性良好，一般在4～60℃较为稳定，pI多数在4～8之间，重金属对几丁质酶活性具有不同程度的影响，大多数重金属抑制几丁质酶活性。

2.2 几丁质酶活性测定方法

几丁质酶活性的测定技术一般分为两种类型：定性分析和定量分析。定性分析方法主要利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，添加几丁质为底物，利用几丁质酶可以分解几丁质，在电泳结束后看凝胶上产生的条带以此定性分析几丁质酶活性，或者用样本（含几丁质酶）直接和胶状几丁质培养基反应，观察出现透明圈大小和清晰程度，以此判断几丁质酶活性。定量分析目前有很多方法，原理主要是通过测定底物（几丁质）与酶（几丁质酶）发生反应，测定产物的量，如用DNS法测产物的还原糖[17]，Folin-酚法测N-乙酰氨基葡萄糖量。另外还有一种方法应用比较广泛，利用几丁质酶水解人工合成的寡聚物4MU-（GlcNAc）n，测定反应中产物的量反映几丁质酶的活性，如以4MU-（GlcNAc）3为底物被几丁质酶水解后可以释放具有荧光的4MU，而底物本身不具有荧光值，在特定的波长范围内测定产物的荧光强度，可反映几丁质酶的活性[18]，因荧光分析灵敏度较高，所以现在多采用此方法分析几丁质酶的活性。

3 昆虫几丁质酶的应用

几丁质虽然是世界上含量仅次于纤维素的生物聚合物，但在高等生物体内并不存在几丁质，所以人们可以利用几丁质酶防治害虫而对环境和人类不产生危害。目前昆虫几丁质酶已经应用到多个方面，如可作为转基因作物、病毒增效、生物杀虫或杀菌剂以及几丁质废物利用等。

3.1 几丁质酶在生物防治方面的应用

因几丁质酶单独作用的杀虫效果并不显著，但是把几丁质酶添加在杀虫剂和抗真菌剂中却具有增效作用，同时能够减少使用剂量达到同等效用，在病原生物控制剂研究方面可以联合用药，防止过量化学药剂破坏环境和对人体健康造成危害[19]。多种几丁质酶的协同作用高于一种几丁质酶的作用，可以研究几丁质酶和蛋白酶之间的联合应用以提高实际杀虫效果，如Kunert等将纯化的几丁质酶CH143与其他3种蛋白酶结合处理根结线虫（Globbodera pallida）的虫卵表面，使虫卵出现伤痕和破损，寄生在卵上的真菌会迅速侵染虫卵导致线虫死亡，达到控制害虫的目的[20]。同时，几丁质酶也可以防止果蔬采摘后病原微生物引发的腐烂，防止在贮藏和运输过程中造成经济损失及危害人体健康，具有经济效益[21]。此外，应用重组技术开发昆虫病原体为害虫生物防治提供了潜在的新方法。昆虫专一性的病原微生物（如杆状病毒）也是生物防治的重要载体，具有宿主范围窄、对脊椎动物无毒和环境友好等特征，将昆虫几丁质酶与杆状病毒联合应用，可增强杆状病毒的杀虫活性。Gopalakrishnan等人在苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）加入了烟草天蛾几丁质酶合成重组病毒，将重组病毒注射入虫体，调节烟草天蛾幼虫中的几丁质酶的表达量，实验组死亡率明显高于对照组[22]。范晓军等用东亚钳蝠昆虫神经毒素基因和烟草天蛾几丁质酶基因，以AcMNPV为载体，合成重组病毒注射于中国棉铃虫中，结果显示实验组杀虫率升高，而将重组病毒感染小鼠，小鼠生理指标均正常，此类杀虫剂对哺乳类动物安全。由此可见，昆虫几丁质酶和昆虫病原病毒联用是具有发展成为新型生物杀虫剂的巨大潜力[23]。

3.2 昆虫几丁质酶在转基因植物中的应用

有研究表明，植物几丁质酶基因或细菌几丁质酶基因的转基因作物，可以使植物获得对病原体的抗性，昆虫几丁质酶的转基因植物也获得了良好的昆虫防治效果。Masoud和Ding等将来源不同的四种几丁质酶转基因用到烟草中，实验研究表明，用细菌或植物几丁质酶转基因的烟草喂食虫体对虫体无任何影响，而用昆虫几丁质酶转基因的烟草喂食的幼虫则出现死亡[24]，结果表明，昆虫几丁质酶的转基因植物具有良好的抗虫效果。张志云和张虎生等将烟草天峨的几丁质酶和东亚钳蝠昆虫的神经毒素转基因到棉花中，明显提高了棉花对棉铃虫的抗性[25]。Gatehous等将昆虫几丁质酶转基因到马铃薯中，提高了植物对蚜虫的抗性[26]。Gamal等将棉贪夜蛾的几丁质酶转基因到玉米中，用转基因玉米植物饲养玉米蛀虫，50%昆虫则出现死亡，且转基因玉米植物还具有较强的抗链球菌抗性[27]。

昆虫几丁质酶转基因作物虽然有明显的效果，但是昆虫几丁质酶转基因的植物作为一种口入杀虫剂对抗害虫，其抗虫害的效用与害虫的围食膜或害虫的围食膜厚度有着密切关系，如果害虫围食膜过厚或根本没有围食膜的生理结构，则达不到理想的杀虫效果，同时在转基因植物中昆虫几丁质酶的表达易被降解，导致其杀伤效果不显著，在实际应用上仍存在许多难题，但随着科技的进步和研究的深入，昆虫几丁质酶基因将会得到越来越多的应用。

4 结语与展望

几丁质酶是昆虫发育过程中蜕皮和围食膜降解的关键酶，是昆虫发育研究和探索害虫控制新策略的重要途径之一。几丁质酶过量或者缺失的表达都会对昆虫的生长发育产生影响，而在高等动植物中本身不含有几丁质，所以几丁质酶对其他高等动植物来说不具有损害，相对于环境和人体来说都比较安全。转基因植物能提高农作物对害虫的抗性，利用杆状病毒专一性杀害害虫等，可见昆虫几丁质酶的应用前景极为广泛。

RNA干扰技术已是公认的研究昆虫基因功能的重要方法，用来筛选防治有害医学昆虫的药物靶标，有助于加快新型生物农药的研制，在有害昆虫的防治方面将受到越来越多的重视。