MIF在香烟烟雾诱导的COPD大鼠炎症进展中的作用研究

钟 莉, 李天浩, 王惠琴

(陕西中医药大学， 陕西 咸阳 712046)

慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease,COPD) 是一种常见的，多发的呼吸道慢性疾病,最终发展为肺心病和呼吸衰竭等，可危及患者生命。COPD以持续气流受阻、进行性发展为特征，炎症累及气道、肺实质、肺血管乃至全身,且病情随着时间的进展不断地恶化,肺部功能也持续下降；同时，患者一般年龄偏大，机体免疫力急剧下降及各种共患病较多，病情较易反复发作，同时容易发生抑郁、惊恐等精神心理疾病，从而致使患者心理上的不健康和生存质量下降[1]。据2017年疾病负担报告统计显示，随着人口老龄化、慢性病的发病率增加，我国COPD患病率及死亡率逐年上升，现已经成为我国第3大死亡疾病[2]。国内外研究显示,炎症机制在COPD的发病机制中起重要作用，包括多种炎症细胞(如肺泡巨噬细胞、中性粒细胞等)[3]以及炎症因子(MIF、IL-6等)，但由于大多数患者对皮质类固醇具有抗药性，导致目前疗法治疗效果不佳[4]。因此探究COPD炎症机制对于疾病的治疗具有重要意义。巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是一种炎症抑制因子，最初认为是由T细胞介导的抑制巨噬细胞迁移的细胞因子，后来发现其是调节巨噬细胞宿主防御功能的因子，在不同组织中普遍表达具有促炎症、趋化的主要功能[5]。其表达升高通常与炎症情况有关，能反应机体炎症状态，受体结合研究表明MIF通常处于炎症级联的顶端，通过与相应受体(如CD74，CXCR2、CXCR4和CXCR7)结合吸引巨噬细胞及淋巴细胞前往炎症部位发挥促炎趋化作用。多项研究发现MIF的表达和分泌在多种慢性炎症性疾病中增加，如败血症、关节炎、哮喘，及COPD相关肺癌等[6]。本研究采用香烟烟熏法制备COPD大鼠模型，通过ISO-1阻断MIF后观察大鼠不同时间段血清及肺组织的MIF浓度、肺组织MIF的蛋白表达以及血清和肺组织IL-6的变化情况，探讨MIF在COPD炎症发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1实验材料、试剂

1.1.1实验动物:SD大鼠60只，雄性，180～200g，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为：SCXK(京)2016-0011。经过陕西中医药大学伦理委员会审查批准，遵循实验动物学及相关动物保护法进行实验。

1.1.2实验试剂:ISO-1(S7732)(MIF抑制剂)，上海蓝木公司；MIF(YX-E21117)、IL-6(YX-E21185)的ELISA KIT，上海优选公司；Anti-MIF antibody(BA2058)，武汉博士德公司；黄果树牌香烟(焦油量:10mg，烟气烟碱量:0.9mg，烟气一氧化碳量:12mg)。

1.2实验方法

1.2.1大鼠COPD模型制备:将大鼠随机分为3组：分别为模型组、ISO-1组和健康对照组。大鼠适应性饲养一周。模型组和ISO-1组SD大鼠采用单纯烟熏法使其同时、同条件下被动吸烟90d，每日两次(早八点、晚六点开始)，每次2h；ISO-1组在烟熏同时分别在第0～30d、60～90d第一次烟熏前1h腹腔注射ISO-1(0.4mg/kg)溶液；健康对照组和模型组给予等量生理盐水，每日一次。

1.2.2大鼠取材:分别在实验第30d、60d、90d以10%水合氯醛(0.3mL/100g)经腹腔内注射麻醉大鼠，大鼠腹主动脉采血；取双肺组织，并将大鼠左肺下叶固定后石蜡包埋，以备进行HE染色和免疫组化实验，其余部分制备匀浆。

1.2.3酶联免疫吸附法检测血清、肺组织匀浆MIF、IL-6浓度:按照ELISA检测试剂盒说明书流程操作,大鼠血清、肺组织匀浆样品直接加样,按程序添加样本稀释液、辣根过氧化物酶标记的检测抗体反应1h，加洗涤液吸板5次,再依次加入底物A、B，避光孵育15min后加入终止液，终止显色后立即使用酶标仪读取每孔的吸光度(OD)值。通过软件获得标准曲线，计算每个样本的MIF、IL-6浓度值。

1.2.4肺组织免疫组化分析检测MIF蛋白表达:石蜡切片常规脱蜡。依次进行抗原修复→血清封闭→滴加一抗→DAB显色→复染→返蓝→梯度酒精脱水→透明封片→通过图像分析系统观察分析MIF的蛋白表达位置及平均光密度值。每组内每张切片随机挑选至少3个200倍视野进行拍照。应用Image-Pro Plus 6.0软件分析，并求出平均光密度值IOD/AREA(Mean Density)。以平均光密度值的均值(AOD)作为该大鼠切片的蛋白表达值。

1.2.5大鼠肺切片HE染色:将固定在4%多聚甲醛溶液中的肺组织取出，进行包埋后制成石蜡切片，再依次进行脱蜡→水化→苏木素染色→伊红染色→脱水封片，最后显微镜下拍照观察。

2 结 果

2.1大鼠一般情况:健康对照组组大鼠实验期间活动饮食均正常，毛发光泽，精神佳，体重增长迅速，无喘息气促；COPD组大鼠随着烟熏时间的增长，对外界反应能力逐渐下降，呼吸急促伴喘鸣，毛发光泽感欠佳，毛色枯黄，活动减少，饮食饮水减少，体重增长缓慢；ISO-1组大鼠喘鸣情况较轻，饮食尚可，毛发光泽较好，活动及反应能力逐渐恢复，体重增长较慢。

2.2血清及肺组织匀浆MIF检测:随着时间进展模型组血清和肺组织匀浆MIF水平显示出升高趋势，同时在不同时间(30d、60d、90d)均较健康对照组和ISO-1组升高(P<0.05)，ISO-1组血清和肺组织匀浆MIF水平均高于健康对照组(P<0.05)。同一时间比较，ISO-1组血清和肺组织匀浆中IL-6水平与模型组相比明显降低(P<0.05)，与健康健康对照组比较升高(P<0.05)。各时间段健康对照组和ISO-1组大鼠血清和肺组织匀浆MIF水平均无统计学意义(P>0.05)。见表1、表2。

表1 不同时间段各组大鼠肺组织匀浆MIF浓度

表2 不同时间段各组大鼠血清MIF浓度

2.3血清及肺组织匀浆IL-6检测:模型组血清和肺组织匀浆IL-6水平随着时间推移(30d、60d和90d)逐渐升高(P<0.05)。ISO-1组血清和肺组织匀浆中IL-6水平与同一时间模型组相比明显降低(P<0.05)，与健康对照组比较升高(P<0.05)。不同时间段ISO-1组血清和肺组织匀浆IL-6均相比于模型组明显降低(P<0.05)，均高于健康对照组(P<0.05)。各时间段健康对照组和ISO-1组大鼠血清和肺组织匀浆IL-6水平均无统计学意义(P>0.05)。见表3、表4。

表3 不同时间段各组大鼠肺组织匀浆IL-6浓度

表4 不同时间段各组大鼠血清IL-6浓度

2.4肺组织病理改变:①健康对照组：大鼠肺组织形态正常，肺泡大小正常，充气状态良好，肺泡间隔无破坏，支气管及周围无黏液及炎细胞浸润(图1A)。②COPD模型组：持续香烟烟雾造模30d时，肺组织结构中度异常，支气管管腔狭窄，部分上皮细胞变性坏死，管腔内可见炎性渗出物，周围可见大量炎症细胞浸润，部分肺泡融合扩张，形成肺大泡(图1B)。持续香烟烟雾造模60d时，肺组织结构重度异常，支气管大量上皮细胞坏死脱落至管腔，平滑肌明显增厚，周围可见大量炎症细胞浸润，部分肺泡融合扩张，形成肺大泡，炎症细胞数量较第一批模型组明显增加(图1C)。持续香烟烟雾造模90d时，肺组织结构重度异常，支气管管腔扩张，并可见大量炎性渗出物及蛋白黏液，可见坏死粒细胞以及泡沫细胞，部分支气管上皮细胞坏死，周围可见大量炎症细胞浸润，平滑肌增厚，损伤程度较第一批第二批明显增加(图1D)。③ISO-1组：给药30d时，肺组织结构轻度异常，支气管少量上皮细胞变性，脱落，周围部分肺泡融合扩张，形成肺大泡，支气管周围可见少量炎症细胞浸润，数量较模型组明显减少(图1E)。给药60d时，肺组织结构轻度异常，部分支气管上皮细胞变性脱落，周围可见少量炎症细胞浸润，部分肺泡融合扩张，形成肺大泡，损伤程度较第一批治疗组有增加，较第二批模型组明显改善(图1F)。给药90d时，肺组织中度异常，支气管管腔内可见炎性渗出物，平滑肌明显增厚，周围可见大量炎症细胞浸润，部分肺泡融合扩张，形成肺大泡，损伤程度较第三批模型组明显改善，较第一批第二批治疗组明显增加(图1G)。

图1 肺组织病理学改变(HE染色，×200)

2.5免疫组织化学检测肺组织中MIF的表达:免疫组化结果显示，随着时间进展，模型组MIF蛋白表达呈现出升高趋势，模型组和ISO-1组MIF表达均高于健康对照组，其中模型组较ISO-1组各时间段(除外第30d)的肺组织MIF表达均显著增加(P<0.05)；与模型组相比，ISO-1组各时间段肺组织MIF表达显著降低(P<0.05)(图2)。见表5、图3。

图2 MIF平均光密度值(AOD)

表5 不同时间段各组大鼠肺组织MIF蛋白表达AOD值

3 讨 论

本研究结果显示MIF在模型组大鼠中高表达，且随着病情加重，MIF的表达不断升高，同时炎症因子IL-6在模型组血清和肺组织中也高表达，与田王斌等[7]观点一致。而通过抑制MIF后发现，大鼠不同时间段MIF的表达较单纯烟熏的模型组明显降低，仅高于健康对照组；炎症因子IL-6与MIF的表达呈现出明显相关性，研究发现不同时间段ISO-1组IL-6的表达也较单纯烟熏的模型组明显降低，较健康对照组高，表明在COPD的发生发展过程中通过抑制MIF可以抑制其炎症进展。使用ISO-1可以降低臭氧诱导的皮质醇抵抗COPD小鼠的肺部炎症，研究一致支持MIF在COPD中具有促炎作用。同时肺组织病理发现ISO-1组不同时间段的肺部炎症状态均较模型组轻，特别是相较于模型组90d造模成功后的大鼠模型，其肺部炎性改变明显缓解。

COPD的特征是中性粒细胞浸润，小鼠体内低剂量的LPS可诱导富含中性粒细胞的肺部炎症，这可通过抗MIF抗体预防[8]。Magalhaes及其同事还报告了在OVA哮喘模型中，MIF基因敲除小鼠的AHR对乙酰胆碱的反应降低[9]。本研究进一步支持了ISO-1的抗炎作用，因为本研究使用的是不同的大鼠模型证实。相比之下，其他研究在OVA或LPS处理的小鼠模型中均未显示ISO-1对炎症的影响。

抑制MIF的抗炎作用曾在几种疾病模型中报道过。现已证明抗MIF抗体对内毒血症、关节炎败血症和OVA诱导的过敏性哮喘具有保护作用[10,11]。我们的研究是MIF拮抗剂ISO-1首次在香烟烟熏诱导的的COPD大鼠模型中显示出抗炎作用，这也提供了新的证据，表明靶向抑制MIF可能是治疗该疾病患者的一种有用方法。

本研究尚存在以下不足之处：①没有收集临床样本，缺少临床研究验证。②尽管我们证实了ISO-1对于COPD炎症的影响，但未证明对大鼠模型中其他通气功能指标的影响。③本研究过程仅使用了雄性大鼠进行研究，未考虑性别因素的影响。

综上所述，我们探讨了MIF在COPD疾病进展中的作用，结果表明其参与COPD发生发展过程，且在一定程度反映大鼠COPD进展中的炎症状态，同时COPD炎症状态的加重可通过MIF调控来实现，通过ISO-1抑制MIF可减轻香烟烟雾诱导的COPD大鼠肺组织损伤以及炎性因子的表达。因此是否将来可通过靶向抑制MIF来治疗COPD患者，缓解患者肺组织损伤及炎症状态，这为临床上治疗COPD患者提供了一个新的思路，值得更加深入的探讨。