NF-κB Apaf-1蛋白在胃癌组织中的表达及意义

杨 波， 杨 涛， 杨东霞， 张歆萍， 孙海宁, 李佳欣

(1河北省承德市中心医院， 河北 承德 067000 2.承德医学院病理教研室， 河北 承德 067000)

胃癌是我国常见消化道的恶性肿瘤之一，根据最新的癌症统计报告显示，我国胃癌发病率及死亡率均排在第三名[1]，严重威胁人类的健康。尽管胃癌的治疗逐渐系统化，但临床中晚期胃癌患者依旧多见，治疗难度大大增加，五年生存率不到35%[2]。胃癌发病机制错综复杂，与细胞凋亡异常密切相关，正常的细胞凋亡对稳定胃部内环境起到至关重要的作用，一旦癌细胞不受控制发生增殖或是凋亡受到抑制，就会逐步发展为胃癌，因此细胞凋亡成为探究胃癌发病机制中的研究热点。NF-κB是重要的核转录因子，其异常表达对肿瘤进程、细胞凋亡发挥调控作用，Apaf-1作为抗凋亡因子，在胃癌中活化可抑制胃癌细胞的凋亡，发挥负调节功能。但目前关于二者在胃癌中相关性研究少有报道。因此本实验采用免疫组化SP法技术检测NF-κB、Apaf-1在胃癌组织中蛋白的表达变化，分析二者相关性。有助于阐释说明胃癌的发生、发展机制，为胃癌的诊断及治疗提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料:选择2020年1月到2021年1月承德市中心医院、承德医学院附属医院收治的50例胃癌患者手术切除后的组织标本，所有患者经临床病理诊断确诊为胃腺癌，手术前均未进行放、化疗治疗。其中女性18例，男性患者32例；年龄35～74岁，年龄>60岁35例、≤60岁15例；高-中分化20例，低分化30例；有淋巴转移者26例，无淋巴转移者24例；Ⅰ+Ⅱ期27例，Ⅲ+Ⅳ期23例；<深肌层15例，≥深肌层35例。取这50例胃癌患者的癌旁正常组织标本(距离胃癌组织边缘>5cm)作为本次研究的对照。

1.2主要试剂:NF-κB兔抗人多克隆抗体(美国Affinity公司)、Apaf-1兔抗人多克隆抗体(美国Cell Signal公司)、免疫组化试剂盒(北京中杉金桥公司)。

1.3免疫组化SP法

1.3.1染色方法:标本经固定、脱水、包埋，4μm厚切片，根据免疫组化试剂盒说明书步骤进行规范操作，NF-κB(浓度为1∶100)、Apaf-1(浓度为1∶50)，PBS做空白对照。

1.3.2判定标准:经低倍及高倍光学显微镜观察，NF-κB、Apaf-1蛋白主要定位于细胞质中，呈现棕黄色颗粒。每张切片随机选择5个不同高倍视野(×400)，染色强度评分：无色阴性为0分,淡黄色弱阳性为1分,中等黄色阳性为2分,棕黄色或棕褐色强阳性为3分；阳性染色细胞数所占比例评分：阳性细胞数<5%为0分，5%～25%为1分，25%～50%为2分，≥50%为3分。染色强度评分×阳性细胞数评分的乘积综合判定阳性结果：0～1分为阴性(-),2～3分为弱阳性(+),4～6分为中等阳性(++),>6分为强阳性(+++)[3]。

1.4统计学分析:数据使用SPSS26.0统计学软件进行处理，蛋白阳性表达率比较采用配对四格表卡方检验；利用Spearman等级相关分析蛋白表达的相关性，以P<0.05为差异或相关性有统计学意义。

2 结 果

2.1NF-κB、Apaf-1蛋白在胃癌及癌旁正常组织中表达情况:胃癌组织中NF-κB、Apaf-1蛋白的阳性表达率分别为84.0%(42/50)、36.0%(18/50)，癌旁正常组织中蛋白阳性表达率分别是34.0%(17/50)、70%(35/50)，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1、2，表1。

图1 NF-κB 蛋白的表达(SP法，×400)

表1 NF-κB Apaf-1蛋白在胃癌和癌旁正常组织中表达情况

2.2NF-κB、Apaf-1在胃癌组织中的表达与胃癌临床及病理参数的关系：NF-κB、Apaf-1的表达与患者的性别差异、年龄大小均不相关 ( P>0.05)，与胃癌分化程度的高低、有无淋巴结转移、TNM临床分期情况、浸润深度的不同均有关( P<0.05)。见表2。

表2 NF-κB Apaf-1表达与胃癌临床病理参数的关系

图2 Apaf-1 蛋白的表达(SP法，×400)

2.3NF-κB、Apaf-1在胃癌组织中表达相关性：通过spearman相关性分析，本实验研究结果显示，NF-κB、Apaf-1蛋白在胃癌组织中表达呈现负相关关系(rs=-0.36，P<0.05)。见表3。

表3 NF-κB Apaf-1在胃癌组织中表达相关性

3 讨 论

胃癌是一种发病率较高的消化道恶性肿瘤，多数患者早期无不适症状和体征，十分容易漏诊或误诊，因此胃癌的早期诊断就显得尤为重要。恶性肿瘤发生的基础是肿瘤细胞无限增殖和凋亡减少。NF-κB是调控细胞凋亡的重要转录因子[4]，通常与抑制物IKB激酶(IKB Kinase,IKB)相结合被禁锢在细胞质内。当接受相关刺激信号后，IkB发生磷酸化，激活NF-κB进入到细胞核中，寻找靶基因启动子位点发生特异结合，转录作用增强，抑制肿瘤细胞凋亡促进肿瘤的发生[5]。有研究显示在肺癌组织中高表达的NF-κB与分化程度、TNM分期、淋巴结转移、生存期均存在关联[6]。在乳腺癌细胞研究中发现，抑制I-kBα降解，从而降低NF-κB活性，可明显减少乳腺癌细胞的迁移能力[7]。Apaf-1广泛存在于人体正常组织中，作为细胞凋亡的激活剂，促进凋亡小体形成，介导Caspase级联反应诱发细胞凋亡。有研究发现Apaf-1乳腺腺癌、肺癌等肿瘤组织中处于低表达状态[8]。

本研究显示，NF-κB在胃癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，Apaf-1在胃癌组织中的表达低于癌旁正常组织，提示我们二者在胃癌中处于异常表达状态，通过进一步分析发现，二者与胃癌分化程度、淋巴结转移、TNM分期、浸润深度均有关，表明NF-κB高表达、Apaf-1低表达可能对胃癌的侵袭和转移过程发挥积极作用。本实验相关性分析显示，NF-κB和Apaf-1的表达水平呈负相关，提示两者可能以负反馈形式促进胃癌的发生、发展，具体机制尚有待体外细胞系实验研究证实。

综上所述，NF-κB的高表达和Apaf-1的低表达共同促进了胃癌的发生发展，联合检测NF-κB和Apaf-1在临床上对胃癌的早期诊断和评估预后具有重要意义，同时本研究为胃癌治疗新靶点的选择提供了理论依据。