连翘苷调控miR-146a对脂多糖诱导的肾小管上皮细胞HK-2凋亡及氧化应激的影响

梁勇 武军元 刘禹赓 刘波 魏兵 张向群 曾红

(首都医科大学附属北京朝阳医院 1西区急诊科，北京 100043;2急诊科)

急性肾损伤(AKI)是脓毒症最常见、最严重的并发症之一，发病率及死亡率较高，重症监护病房住院患者中约50%的AKI由脓毒症引起〔1〕。脂多糖(LPS)是主要的内毒素之一，其通过诱导氧化应激、炎症反应，凋亡在脓毒症相关AKI发病中具有重要作用〔2〕。AKI可引起肾小管上皮细胞凋亡，而细胞凋亡又进一步促进AKI进展。因此，有效减轻LPS诱导的肾小管上皮细胞凋亡和氧化应激损伤对AKI治疗具有重要意义。连翘苷为中药连翘的主要药理成分，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗过敏、抗肿瘤等多种药理活性。研究证实连翘苷可减轻急性肺损伤肺组织病理损伤程度，抑制炎症反应〔3〕。连翘苷还可改善脓毒症大鼠机体炎症反应、微血管凝血及血管内皮细胞损伤等因素，提高大鼠存活率〔4，5〕。miR-146a是许多心血管疾病的保护因子，上调miR-146a表达可减弱阿霉素诱导的心脏毒性，改善脓毒症诱导的心肌功能障碍〔6，7〕。AKI小鼠肾组织中miR-146a表达降低，褪黑素通过抑制炎症反应，对AKI具有明显治疗作用〔8〕。本研究旨在探讨连翘苷对LPS诱导的肾小管上皮细胞HK-2凋亡、氧化应激损伤的影响。

1 材料与方法

1.1细胞和试剂 人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2购于武汉普诺赛生命科技公司；miR-146a模拟物(mimics)、miR-146a抑制物(inhibitor)、细胞计数试剂盒(CCK)-8、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒购于上海生工公司；逆转录试剂盒、SYBR Green聚合酶链反应(PCR)试剂盒购于北京宝日医生物公司；兔源B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl相关X蛋白(Bax)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体购于美国CST公司；丙二醛(MDA)含量检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)活性检测试剂盒购于北京索莱宝生物公司。

1.2细胞培养和实验分组 HK-2细胞采用补充10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的MEM培养基在含5%CO2、37℃恒温培养箱中培养。细胞70%融合时，按照1∶4比例转移细胞至新的培养瓶培养，换液频率为每周2～3次。采用1 μg/ml LPS干预对数期HK-2细胞6 h记为模型(Model)组〔9〕。Con组正常培养细胞，不用LPS干预。采用5、10、20 ng/ml的连翘苷分别处理LPS诱导的HK-2细胞24 h，依次记为实验1组、实验2组、实验3组。脂质体转染法将miR-146a mimic转染HK-2，转染48 h后进行LPS干预处理记为Model+miR-146a mimic组。将miR-146a inhibitor转染HK-2，转染48 h后进行LPS干预处理6 h，然后用20 ng/ml的连翘苷处理24 h，记为实验3+miR-146a inhibitor组。

1.3实时荧光定量-PCR检测miR-146a表达 TRIzol试剂提取各组HK-2细胞的总RNA，随后用逆转录试剂盒、SYBR Green PCR试剂盒进行逆转录和RT-qPCR。2-ΔΔCt法计算miR-146a相对表达量。miR-146a上游引物5′-GCAGGGTCCGAGGTATTCG-3′，下游引物5′-CGCGTGAGAACTGAATTCCAT-3′；内参U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4CCK-8法检测细胞活力 将各组细胞以每孔2×105个细胞的密度接种96孔板，贴壁后每孔中加入10 μl CCK-8溶液，培养箱继续孵育2 h后，酶标仪分析450 nm处各孔光密度(OD)值。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡 磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，随后用1×结合缓冲液调整细胞密度为1×105个/ml。在100 μl细胞悬液中各加入5 μl的Annexin V-FITC和PI进行暗室染色。补加400 μl的1×结合缓冲液混匀后上机检测细胞凋亡率。

1.6Western印迹检测Bcl-2和Bax蛋白表达 采用补充蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀试验缓冲液提取细胞总蛋白，二喹啉甲酸对总蛋白进行定量。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白样品，湿法转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。将膜置于含有5%脱脂牛奶的洗膜缓冲液中4℃封闭过夜，将膜与一抗室温孵育2 h，将膜再与二抗室温孵育1 h。加入化学发光试剂显色，GAPDH作为内源性对照，Image J软件对目的条带灰度进行定量分析。

1.7试剂盒检测细胞中MDA含量、SOD和GSH活性 收集各组细胞至离心管内，弃去细胞培养液，加入提取液超声破碎细胞，离心收集上清液后置于冰上。按照MDA含量、SOD活性、GSH活性检测试剂盒步骤测定各组HK-2细胞中MDA含量、SOD和GSH活性。

1.8统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析和SNK-q检验。

2 结 果

2.1连翘苷对LPS作用的HK-2细胞活性及miR-146a表达的影响 与Con组比较，Model组HK-2细胞miR-146a表达水平、OD值显著降低(P<0.05)；与Model组比较，实验2组、实验3组HK-2细胞miR-146a表达水平、OD值显著升高(P<0.05)。随着连翘苷浓度的逐步增加，HK-2细胞miR-146a表达水平、OD值逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 连翘苷对LPS作用的HK-2细胞活性及 miR-146a表达的影响

2.2连翘苷对LPS作用的HK-2凋亡的影响 与Con组比较，Model组HK-2细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著升高，Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)；与Model组比较，实验2组、实验3组HK-2细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著降低，Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)。随着连翘苷浓度的逐步增加，HK-2细胞凋亡率、Bax蛋白表达逐渐降低，Bcl-2蛋白逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表2。

1～5：Con组、Model组、实验1组、实验2组、实验3组图1 连翘苷对LPS作用的HK-2凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

表2 连翘苷对LPS作用的HK-2凋亡的影响

2.3连翘苷对LPS作用的HK-2氧化应激的影响 与Con组比较，Model组HK-2细胞SOD和GSH水平显著降低，MDA水平显著升高(P<0.05)；与Model组比较，实验2组、实验3组HK-2细胞SOD和GSH水平显著升高，MDA水平显著降低(P<0.05)。随着连翘苷浓度的逐步增加，HK-2细胞SOD和GSH水平逐渐升高，MDA水平逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 连翘苷对LPS作用的HK-2氧化应激的 影响

2.4过表达miR-146a对LPS作用的HK-2细胞活性、凋亡及氧化应激的影响 与Model组比较，过表达miR-146a后HK-2细胞OD值、Bcl-2、SOD和GSH水平显著升高，凋亡率、Bax、MDA水平显著降低(P<0.05)。见图2、表4。

1，2：Model组、Model+miR-146a mimic组图2 过表达miR-146a对LPS作用的HK-2凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

表4 过表达miR-146a对LPS作用的HK-2细胞活性、凋亡及氧化应激的影响

2.5抑制miR-146a可逆转连翘苷对LPS作用的HK-2细胞活性、凋亡及氧化应激的影响 与实验3组比较，实验3+miR-146a inhibitor组HK-2细胞OD值、Bcl-2、SOD和GSH水平显著降低，凋亡率、Bax、MDA水平显著升高(P<0.05)。见表5、图3。

表5 抑制miR-146a可逆转连翘苷对LPS作用的HK-2细胞活性、凋亡及氧化应激的影响

1，2：实验3组、实验3+miR-146a inhibitor组图3 抑制miR-146a可逆转连翘苷对LPS作用的HK-2凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

3 讨 论

连翘苷为连翘的主要化学成分之一，具有清热、解毒、散结排脓等功效，长期用于治疗风热感冒、发炎、淋病、丹毒和溃疡〔10〕。研究显示，连翘苷在急性肺损伤、AKI中具有潜在保护作用。Zhong等〔11〕研究显示，连翘苷可显著减轻LPS诱导的肺组织病理学改变，抑制肺泡出血、中性粒细胞浸润及促炎细胞因子分泌，改善肺水肿。Zhang等〔12〕证实连翘苷可抑制活性氧产生、降低组织蛋白酶L和肝素酶在体内外表达水平，抑制炎性细胞因子分泌进而改善AKI小鼠肾脏功能。与上述保护作用一致，促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2之间的平衡是线粒体途径调控细胞凋亡的关键，Bax表达增加和Bcl-2表达降低可诱导线粒体膜孔形成，促进凋亡蛋白释放进而诱导细胞凋亡〔13〕。氧化应激在诱导细胞凋亡中起重要作用。本研究结果提示连翘苷可提高HK-2细胞的抗氧化应激能力进而减轻LPS诱导的氧化应激损伤。

miRNA是转录后基因表达的负调控因子，其通过与靶mRNA的序列特异性结合导致翻译抑制或mRNA降解与心血管疾病、癌症和肾脏疾病等多种疾病的发生和发展有关〔14〕。研究显示miR-146a表达降低与缺氧诱导的心肌细胞损伤〔15〕、肝缺血再灌注损伤〔16〕、LPS诱导的急性肺损伤〔17〕有关。糖尿病肾病患者肾小球中miR-146a表达降低〔18〕。干扰肺腺癌转移相关转录本(MALAT)1表达通过上调miR-146a显著抑制炎性细胞因子分泌和免疫反应，增加细胞活力，减轻LPS诱导AKI〔19〕。此外，白藜芦醇、雷公藤甲素通过上调miR-146a表达对LPS诱导的小胶质细胞BV2、HaCaT细胞的炎症损伤具有保护作用〔20，21〕。本研究结果提示连翘苷对LPS诱导的HK-2细胞凋亡和氧化应激损伤的保护作用可能与miR-146a增加有关。进一步验证miR-146a功能显示，过表达miR-146a显著增加HK-2细胞活力，提高SOD、GSH活力，降低MDA含量，减弱LPS诱导的HK-2细胞凋亡，与连翘苷的保护作用一致。此外，抑制miR-146a显著降低20 ng/ml连翘苷预处理对LPS诱导的HK-2凋亡和氧化应激损伤的影响。这说明连翘苷通过上调HK-2细胞中miR-146a表达进而减轻LPS诱导的细胞凋亡和氧化应激损伤。