鲜广地龙纯化蛋白的制备及其体外抗肺纤维化活性评价

地龙为环节动物门钜蚓科动物，根据2020版《中国药典》规定，广地龙归属为参环毛蚓Pheretima aspergillum。始记于《神农本草经》，其性寒、味咸，归肝、脾，膀胱经，主通经活络、平肝熄风、平喘利尿。广地龙作为广东道地药材，目前的研究较多偏向于单味药和复方制剂，地龙的单味药研究偏向于蚓激酶的研究，主要功效体现在溶栓，抗凝血和抗炎。在地龙复方的研究中，发现补阳还五汤具有较好的止咳平喘、治疗心血管疾病等作用。在地龙单味药以及复方的研究基础中发现地龙在肺部疾病的治疗上有巨大的治疗前景。但对地龙蛋白的研究却很少，目前的关于地龙蛋白的研究主要集中在免疫调节和对高血压的治疗，但是提取方式都较为简单，只是进行匀浆提取，很少对蛋白进行纯化，会导致得到的地龙蛋白含有较多的杂质，在一定程度上减弱治疗效果。本实验立足广地龙体内含有丰富的蛋白质及各种酶类成分，且结合现代药理学研究，基于地龙蛋白中含有丰富的超氧化物歧化酶及纤溶酶，具有溶栓、抗氧自由基等药理作用。目前地龙蛋白提取物在纤维化疾病的研究较少，并主要集中在前期的抗炎作用的研究，如肺炎、哮喘等疾病的治疗和伤口愈合方向，还未对肺纤维化疾病进行挖掘，而近年来，临床中各种肺纤维化疾病的数量急剧上升，其中西药大多价格昂贵并存在严重的不良反应，例如吡非尼酮就存在严重的胃肠道反应和皮肤光敏反应，因此研究新的抗肺纤维化药物具有积极的临床意义。因此结合课题组前期工作，发现经典中药制剂芩百清肺浓缩丸（含地龙）可对肺炎有较为不错的治疗效果，并且在去除地龙单味药后，药效显著下降。基于此，本研究选择鲜广地龙，完善地龙蛋白的提取和分离纯化，同时探讨其纯化蛋白的体内及体外的抗肺纤维化活性。

1 材料和方法

1.1 药材来源

鲜广地龙购自于广东省佛山市信宜地龙养殖基地，由南方医科大学中医药学院田恩伟教授鉴定为广地龙。

1.2 试剂与主要仪器

MRC-5细胞（KeyGEN）；胎牛血清、MEM、非必需氨基酸、青霉素/链霉素双抗溶液（Gibco）；CCK8（biosharp）；PAGE 凝胶快速制备试剂盒10%（雅酶）；SDS-PAGE 电泳仪（Bio-Road）；逆转录试剂盒、sybr green（TOYOBO）；Trizol（Invitrogen）；抗 体α-SMA、Vimentin、E-cadherin、Collagen I（CST）、Smad2、Smad3、P-Smad2 和P-Smad3（CST）；细胞凋亡检测试剂盒（Beyotime）；排阻色谱superdex 200 16/60（GE HiLoad）；博来霉素（杭州汉辉制药有限公司）；凝胶成像分析仪（Bio-Road）；H&E、Masson染色试剂盒（福州迈新生物科技有限公司）；实时荧光定量PCR 仪（LightCycler96）；多维高清流式细胞分析仪（BD LSRFortessa X-20）；超高分辨三合一质谱仪（Thermo Scientific™Orbitrap Fusion™Tribrid™）。

1.3 鲜广地龙蛋白的纯化、定性检测和质谱分析

将鲜广地龙剪碎，去除血液、内脏和泥沙等。迅速使用液氮冷冻后研磨，过40 目筛后进行冷冻干燥处理。取适量冻干粉末，加PBS溶液进行匀浆破碎，离心浓缩取上清液，用排阻色谱分离纯化得到鲜广地龙纯化蛋白（P2）。SDS-page 法定性检测P2，结果用Image Lab 3.0进行分析。选用超高分辨三合一质谱仪对得到的P2进行LC-MS分析。

1.4 细胞活力分析实验

MRC-5细胞培养在采用含10%胎牛血清，1%非必需氨基酸，100 U/mL青霉素100 μg/mL链霉素的MEM培养基于37 ℃，5%CO培养箱中。

苏木精和伊红（H&E）染色，Masson三色染色用于评估鲜广地龙蛋白的抗纤维化作用。H&E染色显示模型组小鼠肺泡间隔增加水肿增厚；肺泡的结构隔膜明显被破坏，聚集了大片炎症细胞的数量（图7）。与模型组相比，鲜广地龙纯化蛋白P2减少了肺纤维化小鼠肺泡结构的破坏和炎症细胞聚集，同时Masson染色显示鲜广地龙纯化蛋白P2处理后，肺纤维化小鼠蓝染胶原纤维的区域在支气管周围、血管周围和肺泡间隙都有所减少。

1.5 纯化蛋白P2对TGF-β1诱导的MRC-5细胞异常增值的影响

左肺在4%多聚甲醛中固定≥72 h。首先清洗组织，在分级乙醇中脱水，包埋在加入透明剂后的石蜡中，切成4 μm厚切片。HE和Masson染色按照制造商的说明进行染色。在徕卡显微镜（200×；Leica DM 3000，Leica Company，Germany）下拍摄照片。

1.6 流式细胞术检测肌成纤维细胞凋亡

实验选取成年雄性8周龄C57BL/6小鼠，体质量22～26 g，购自中国广东药康科技有限公司。所有C57BL/6小鼠在特殊的无病原体条件下饲养，在12/12 h光/暗循环下和（25±2）℃和（50±5）%的湿度下的房间中饲养，并且可以不受限制地获取食物和水。所有动物实验均获南方医科大学伦理委员会批准（批准文号：2021004）。将C57BL/6小鼠随机分为3个处理组（8只/组），对照组（不处理），模型组（5.0 mg/kg博来霉素处理），博来霉素+鲜广地龙纯化蛋白P2（5 mg/mL）。在第0天，将C57BL/6小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）。麻醉后将其仰面在无菌的手术台。对小鼠前颈部区域的皮肤常规准备和消毒，用眼科剪刀将颈部皮肤沿着中线切开，直至完全暴露小鼠的气管。将1个1 mL注射器针头弯曲成钝角以刺破气管，沿气管壁慢慢滴下制备好的博来霉素溶液。将除对照组以外的小鼠气管内给予单剂量5.0 mg/kg 博来霉素（溶解在0.9 %生理盐水中）。C57BL/6对照组小鼠气管内滴注等量的生理盐水。使用可吸收缝合线缝合手术切口。连续腹腔注射鲜广地龙纯化蛋白（P2）21 d，小鼠在第22天进行安乐死。左肺用4%多聚甲醛固定，右肺立即储存在-80 ℃的冰箱中以备后续使用实验。

1.7 RT-PCR 检 测α-SMA、Vimentin、E-cadherin 和Collagen I基因表达

按方法1.4处理方式的各组细胞，使用Trizol从目标细胞中分离总RNA，根据方案使用Toyobo第一链合成方案合成第1链cDNA。所有引物均由上海生工公司合成（表1），以cDNA为模板，使用定量SYBR染料试剂盒进行后上机进行检测。将GAPDH的mRNA水平用作内部对照。

1.8 Western blot 检测α-SMA、Vimentin、E-cadherin 和Collagen I蛋白表达及TGF-β/Smad通路

按方法1.4处理方式的各组细胞，提取总蛋白样品，BCA法测定蛋白浓度，蛋白样品与上样缓冲液1∶4混合均匀后，按每孔20 μg蛋白上样进行凝胶电泳。使用以下一抗：α-SMA（1∶1000），E-cadherin（1∶1000），Vimentin（1∶1000），Collagen I（1∶1000），Smad2（1∶1000），Smad3（1∶1000），P-Smad2（1∶1000），P-Smad3（1∶1000），GAPDH（1∶1000）。加入一抗后在4 ℃下过夜孵育并回收，TBST洗膜3次，15 min/次，加入二抗（1∶5000，BOSTER）孵育2 h。TBST 洗膜3 次，每次15 min，最后使用增强化学发光（ECL）对信号进行可视化，结果使用ImageJ软件进行定量强度分析。

同样是金枝玉叶的段誉，第一次来燕子坞吃的那些：“茭白虾仁”“龙井茶叶鸡丁”，看看就教人馋涎欲滴。段誉的当时心理评判是这样的：“鱼虾肉食之中混以花瓣鲜果，色彩既美，自别有天然清香。”

1.9 动物实验

按方法1.4收集各组细胞，PBS液清洗细胞，离心后加入结合缓冲液调整细胞密度为1×10/mL。取细胞悬液进入到流式管，分别加入Annexin V-FITC和PI，冰上避光孵育15 min，立即上机检测细胞凋亡情况。

1.10 病理分析

实验分组：Control组（正常培养的MRC-5细胞）、Model组（5 ng/mL的TGF-β1处理）、SB431542组（2μmol/L的SB431542处理）、P2组（13.125 μg/mL的P2处理），其余操作及处理方法同1.4。

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（二）抗体检测 通过新城疫抗体检测比较发病前后的抗体情况，如果发病前抗体水平高，且抗体滴度比较均匀，而发病后新城疫抗体变得参差不齐，即可作出诊断。

1.11 统计学分析

对冷冻干燥法提取的鲜广地龙蛋白进行分离纯化，纯化结果分别记为将P1、P2、P3、P4、P5（图1）。其中P1、P3、P4 及P5 基本没有蛋白质，样品主要集中在P2。BCA法测量得到P2的蛋白浓度为1.39 mg/mL。将纯化蛋白P2的质谱数据进行蛋白数据库检索汇聚，鉴定得到蛋白质91个，多肽290个。

2 结果

2.1 鲜广地龙纯化蛋白P2的SDS-page和LC-MS的分析结果

通过Graphpad Prism软件进行处理，正态分布的数据使用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD或Dunnett方法。以＜0.05为差异有统计学意义。

2.2 纯化蛋白P2抑制TGF-β1诱导MRC-5细胞异常增殖

实时聚合酶链反应显示，5 ng/mL TGF-β1刺激的模型组中α-SMA、Vimentin和CollagenI升高，及E-cadherin mRNA 表达减少（＜0.001）。与模型组相比，2 μmol/L SB431542可以显著降低α-SMA、Vimentin和Collagen I 的表达，增加E-cadherin 的表达（＜0.001）。与模型组相比，纯化蛋白P2治疗可逆转TGF-β诱导的α-SMA、Vimentin 和Collagen I 的表达降低和E-cadherin的表达增高（＜0.001或＜0.01，图4）。

根据表5psm后回归结果，就全样本而言，Sub与Own在10%的显著水平上正相关，验证了政府补助的信号效应。分别按照企业Roa与Roe进行分组后，发现当企业的总资产报酬率与净资产报酬率为负时，Sub与Own的回归结果不显著。企业盈利能力不足时，政府补助不能有效发挥引导社会投资的信号效应。

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2.3 纯化蛋白P2促进肌成纤维细胞凋亡

通过流式细胞术检测纯化蛋P2对肌成纤维细胞的细胞凋亡的影响。汇总第2象限的凋亡细胞进行统计分析显示，Control组与Model组几乎无细胞凋亡（＜0.001），而纯化蛋白P2能有效促进肌成纤维细胞的凋亡（＜0.001，图3）。

2.4 纯化蛋白P2 对TGF-β1 诱导MRC-5 细胞中α-SMA、Vimentin、Collagen I 和E-cadherin 的mRNA 的调节作用

TGF-β1可促进MRC-5细胞向肌成纤维细胞转化，通过细胞增值率确定最佳TGF-β1刺激条件，与Control组相比，5 ng/mL的TGF-β1差异有统计学意义（＜0.01），确定了TGF-β1的最佳刺激浓度为5 ng/mL。后探究纯化蛋白P2的安全给药浓度，随P2的浓度增加，其对细胞的抑制效果逐渐明显，结果表明剂量为13.125 μg/mL的纯化蛋白P2适合用于进一步的实验。综上，建立TGFβ1诱导的体外肺纤维化模型后给予纯化蛋白P2，与对照组相比，TGF-β1（5 ng/mL）组中肌成纤维细胞数目明显增多，2 μmol/L SB431542和13.125 μg/mL纯化蛋白P2均可抑制肌成纤维细胞的增殖（＜0.01，图2）。

2.5 纯化蛋白P2对TGF-β1 诱导MRC-5细胞中α-SMA、Vimentin、Collagen I 和E-cadherin的蛋白表达的调节作用

免疫印迹显示5 ng/mL TGF-β1刺激的模型组中增加了α-SMA、Vimentin和Collagen I指标的升高，E-cadherin蛋白表达的减少（＜0.01）。与模型组相比，2 μmol/L SB431542可以显著降低α-SMA、Vimentin和Collagen I蛋白指标的表达量，并升高E-cadherin蛋白的表达。与模型组相比，纯化蛋白P2可降低α-SMA、Vimentin和Collagen I的蛋白水平。相反，上皮细胞标志物的E-cad的蛋白表达增高（＜0.001或＜0.01，图5）。

2.6 纯化蛋白P2对TGF-β1 诱导MRC-5细胞中TGF-β/Smad通路的调节作用

免疫印迹显示5 ng/mL TGF-β1刺激的模型组中Smad2、Smad3指标升高，且P-Smad2和P-Smad3蛋白表达的同样上升（＜0.05）。与模型组相比，2 μmol/L SB431542可以显著降低Smad2、Smad3蛋白指标的表达量，类似的效果同样出现在抑制P-Smad2和P-Smad3蛋白的表达。与模型组相比，纯化蛋白P2 可降低Smad2、Smad3的蛋白水平。但对P-Smad2和P-Smad3蛋白的抑制弱于SB431542（＜0.001或＜0.01，图6）。

2.7 纯化蛋白P2对肺组织的病理学检测

MRC-5细胞接种于96孔板，在37 ℃在培养24 h，分别加入不同浓度（0、0.625、1.25、2.5、5、10、20 ng/mL）的TGF-β1或不同浓度的的P2（1.6406、3.2813、6.5625、13.125、26.25、52.5、105、210 μg/mL）处理，培养48 h后，加CCK-8孵育2 h，读取吸光度（）值。根据下列公式计算细胞存活率：

为保证检验数据的及时、准确、可靠，中心要对实验室专业技术人员进行国家监督抽检实施细则的培训和学习，结合抽检工作实际，制定监督抽检及风险监测专项质量控制计划，采取人员比对、留样再测、仪器比对等方式开展质量监控工作，第一时间为行政决策提供准确可靠的依据。

3 讨论

地龙是中国传统的中药材之一，是中医治疗高热惊厥、支气管哮喘的常用药物。目前国内外的研究侧重于对广地龙水煎液及醇提液的研究，发现其功效多集中在平喘和心血管保护，例如通俗环毛蚓水提液的研究已经细化为醇沉部分、酸性部分和碱性部分。目前发现酸性部分可在组胺诱导的豚鼠气管痉挛实验中展现出较好的解痉作用，醇沉部分次之，而碱性部分效果十分微弱。除单用地龙外，地龙复方制剂的平喘活性也有研究，如五味地龙汤可通过发挥抗炎平喘活性来治疗哮喘豚鼠。但这些方法均会使大量的蛋白质失活，这对于含有丰富蛋白质的动物药的研究来说有巨大影响。已有的关于地龙蛋白的研究则较少，还多集中于使用磷酸盐缓冲液直接提取，此法提取会包含较多杂质蛋白，不利于地龙蛋白的进一步研究及市场应用。其次地龙蛋白作为一种生物大分子在实际使用中存在一些问题，诸如易降解，纯度不够和运输困难等，因此寻找一种易获得并稳定的蛋白纯化方式显得尤为重要；目前对肺纤维化疾病的作用基础还不明确，缺少有效的治疗药物。因此本实验立足于对鲜广地龙蛋白的研究，试图从纯化制备及体外实验两方面来阐述地龙蛋白的药理作用及功效。

入院后当日或次日清晨采集空腹血标本，采用自动生化分析仪测定空腹血糖、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。酶联免疫吸附试验测定脂蛋白(a)[Lp(a)]水平。用标准方法直接测定低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。

本实验通过对鲜广地龙进行低温冷冻干燥，不仅操作方便并可确保地龙蛋白成分最大程度的保持活性。首次利用具有半衰期长、作用强等特点的排阻色谱，根据地龙蛋白分子大小、形状差异来达到分离纯化鲜广地龙蛋白，不仅简化了纯化步骤，而且缩小了鲜广地龙蛋白的研究范围，最终将相对分子质量在20～45 000之间的鲜广地龙纯化蛋白（P2）确定为后续实验的成分，通过质谱分析共鉴定得到91个蛋白质，并分析得到针对肺纤维化疾病的P06702蛋白，为其治疗肺纤维化提供了理论依据。

肺纤维化是一种慢性，进行性间质性肺病，会引发患者生活质量严重下降。临床病理显示在肺纤维化区域，具有Collagen I的高度表达，成纤维细胞会分化成肌成纤维细胞，高度收缩的肌成纤维细胞会对凋亡产生抵抗。TGF-β1与免疫反应，炎症、基质合成、细胞的生长息息相关，被认为是最关键的纤维化因子。本实验结果表明，在TGF-β1诱导体外肺纤维化模型中，13.125 μg/mL的P2组可以对肌成纤维细胞有显著的抑制和凋亡诱导作用，结果与先前的研究结果类似。多项研究表明，在纤维化疾病中，α-SMA、Vimentin和E-cadherin是器官纤维化的重要评判指标，Collagen I是病理Masson染色中的主要检测指标。通过抑制α-SMA、Vimentin和Collagen I的表达和升高E-cadherin的表达，被视为鲜广地龙纯化蛋白（P2）初步具有抗肺纤维化活性。进一步的信号通路选择TGF-β/Smad为研究对象，Smad2和Smad3是两个主要的下游调节器促进TGF介导的组织纤维化。Smad2和3诱导细胞内信号转导共激活下游促纤维化蛋白表达。实验结果表明，13.125 μg/mL P2 可降低Smad2、Smad3 以及P-Smad2和P-Smad3的蛋白表达。动物实验中，H&E和Masson染色的病理结果显示，鲜广地龙纯化蛋白（P2）对炎症和纤维化的治疗有积极效果，显著降低了H&E中红色的炎症区域和Masson中蓝染的胶原蛋白区域，其效果优于地龙复方的治疗。因此本实验认为，鲜广地龙纯化蛋白（P2）对肺纤维化的治疗有较好的治疗效果。

综上所述，本实验得到了一种可稳定制备鲜广地龙纯化蛋白的方法，并首次发现得到的鲜广地龙纯化蛋白（P2）可通过抑制肌成纤维细胞表达，调控纤维化指标等起到体内及体外抗肺纤维化的作用。该实验丰富了鲜广地龙的使用范围，为地龙蛋白的研究寻找了新的研究方向。本实验证明纯化蛋白（P2）与地龙煎剂和地龙复方一样，均对肺部疾病有一定的积极治疗效果，也为其他中药动物药的研究提供了新的思路和想法。机制研究表明鲜广地龙纯化蛋白（P2）对TGF-β/Smad通路有较好的调控，为其在肺纤维化临床中的应用奠定相关的理论基础。