二氢杨梅素的体外护肝作用：基于脂噬介导的LO2 细胞脂质蓄积及HepG2细胞增殖

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指除酒精和其他明确肝脏损伤因素外，以肝细胞脂肪过度堆积、脂肪变性等为主要特征的临床综合征，并可能导致非酒精性脂肪性肝炎、肝细胞癌（HCC）和肝硬化等严重后果。NAFLD 起病隐匿，缺乏早期临床症状，尚未有防治NAFLD的特效药物。NAFLD患者常常伴有自噬通量受损的现象，自噬体将细胞内脂滴包裹运输到溶酶体，特异性结合形成自噬溶酶体并将脂滴降解成游离脂肪酸的过程称为脂噬。研究发现，自噬激活能够减少脂滴形成和肝脏甘油三酯沉积，改善NAFLD。雷帕霉素（mTOR）通过调节自噬相关蛋白和溶酶体的生物合成在自噬中发挥负调节作用。AMPK是mTOR的上游调节关键分子，据报道，调节AMPK/mTOR通路可以有效减轻脂肪肝变性，AMPK/mTOR通路可能是基于自噬防治NAFLD的重要靶点。

二氢杨梅素（DMY）是一种常见的膳食天然活性物质，其化学本质是2,3-二氢黄酮醇化合物，具有抗氧化、抗肿瘤、细胞死亡介导和代谢调节等作用。研究发现，DMY能够改善NAFLD患者的血脂、血糖水平，但其机制尚不清楚。DMY可通过调节自噬途径对损伤细胞进行修复，并缓解肝细胞脂肪沉积，提示DMY可通过脂噬调节肝脏中的脂质代谢途径，但它能否通过影响AMPK/mTOR途径促进脂噬尚未见报道。因此，本研究基于AMPK/mTOR介导的脂噬的崭新防治思路来探索DMY对NAFLD的防治机制。

NAFLD 后期发展严重将会导致HCC，但目前HCC缺乏有效治疗措施。已有研究证实DMY抑制肝癌细胞的增殖，DMY 的前体物质杨梅素可诱导HepG2细胞的凋亡，但其机制尚未阐明。本研究将从细胞周期及DNA断裂两方面来研究DMY对HepG2的促凋亡机制。

本研究建立胎牛血清（FBS）诱导人肝细胞LO2脂肪变性模型，并通过探究对自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）、AMPK、mTOR、自噬关键分子酵母Atg6同系物（Beclin1）及p62的mRNA表达的影响初步探讨DMY基于AMPK/mTOR介导的脂噬对LO2细胞脂质蓄积的防治作用；观察DMY对HepG2细胞增殖抑制作用并探讨其分子机制，探索DMY对NAFLD发生、发展的防治作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

DMY（阿拉丁），LO2和HepG2细胞系（美国典型培养物保藏中心）。磷酸盐缓冲液、DMEM培养基、青霉素-链霉素和胎牛血清（Gibco）。油红O染色试剂盒、二辛可宁酸（BCA）检测试剂盒、天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）和乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（南京建成）。总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）检测试剂盒（北京BHKT）。脱脂奶粉、吖啶橙（AO）（Sigma）。抗GAPDH和抗轻链3（LC3）抗体（Cell Signaling Technology）。细胞自噬染色检测（MDC）试剂盒（碧云天）。

1.2 实验方法

1.2.1 LO2肝细胞脂肪变性模型的建立 采用FBS诱导LO2细胞建立脂肪变性模型。研究分为7组，各组均进行油红O 溶液染色测定脂滴含量：模型组：50% FBSDMEM 培养LO2 细胞24 h；阳性对照组：100 μg/mL DMY处理24 h；处理组：在不含DMY的50%FBS-DMEM培养24 h，后在梯度浓度DMY（50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL DMY）中处理24 h。恢复对照组：50%FBSDMEM中培养24 h，后在10%FBS-DMEM中培养24 h。DMY预处理：造模前使用DMY处理24 h。

1.2.7 实时荧光定量PCR（q-PCR）检测AMPK/mTOR通路自噬相关因子mRNA表达水平 100 μg/mL DMY处理LO2正常细胞24 h后，使用50%FBS造模24 h，1 mL TRIzol 收集细胞，后加入200 μL 氯仿，12 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上层清液400 μL，加入等体积异丙醇，12 000 r/min，4 ℃离心10 min，75%乙醇洗涤沉淀2次，Nano drop 2000c（Thermo Fisher Scientific,ND2000）测定RNA浓度及纯度并逆转录为cDNA，以cDNA为模板使用实时荧光定量PCR 仪（Thermo Fisher Scientific，StepOnePlus）进 行Quantitative Real-time PCR扩增，运用2法计算mRNA的相对表达量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成，具体引物列表如下表1。

1.2.3 AO 染色鉴定细胞内自噬溶酶体的形成与分布使用100 μg/mL DMY处理正常LO2细胞12 h，后加入1 μg/mL AO染料染色20 min，PBS溶液冲洗3次。采用荧光显微镜（Olympus，IX-73）在波长460～495 nm范围内，通过蓝色激发滤光片捕获最终图像。

1.2.4 透射电子显微镜观察细胞内自噬体的形成与分布100 μg/mL DMY处理LO2正常细胞12 h后，收集细胞沉淀。预冷的2.5%戊二醛固定细胞并制备成切片，透射电子显微镜（TEM）（Hitachi 7500）下观察、记录结果。

1.2.5 Western blot测定自噬关键蛋白LC3的表达情况收集各组细胞并提取蛋白备用。12%SDS-PAGE电泳分离总蛋白，转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，后分别加入LC3和GAPDH抗体于4 ℃孵育过夜。TBST溶液洗膜3次，加入二抗室温孵育2 h。最后，使用试剂盒可视化目标条带并进行统计学分析。

3）环保效益。由于套管气含有H2S、CO等有害气体，排放到大气中将污染环境，其温室效应是C02的21倍。有毒气体严重地影响了石油企业的职工和当地群众的身心健康。

2.2.1 DMY纠正LO2细胞的脂质代谢紊乱 阳性对照组与对照组相比，AST、ALT、LDH酶活性差异无统计学意义（＞0.05，表2），但模型组的AST、ALT、LDH酶活性较对照组分别高3.0、5.8、1.9倍（＜0.05）；与模型组相比，DMY处理组LO2细胞ALT、AST和LDH水平显著下降（＜0.05），高剂量组的AST、ALT、LDH酶活性恢复到对照组水平（＞0.05）。恢复对照组的相关酶活性较模型组比有所下降（＜0.05），但仍为对照组的2.4、2.7、1.1倍（表2）。

1.2.2 TC、TG、LDL水平和AST、ALT和LDH酶活性测定 收集各组细胞的上清液，按照试剂盒说明书对TC、TG、LDL含量水平和AST、ALT和LDH的酶活性进行测定。

1.2.8 细胞凋亡和细胞周期阻滞试验DMY（50、100、200 μg/mL）处理HepG2细胞48 h后使用胰蛋白酶消化，获得细胞沉淀。细胞分成两组，一组加入Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）溶液避光孵育15 min，一组用PI染色作为空白对照。流式细胞仪于488 nm激发波长下检测细胞凋亡率。

播种前通常需要人工选择种子，并去除一些有病斑、虫咬、碎屑和破损的种子。播种前5～10天，待播大豆种子在阳光下摊开3～5天的干燥时间，用来提高大豆种子的酶活性，提高种子的发芽率，需要注意经常翻转。种子在阳光下。种子干燥后，按1:70～100的比例混合35%的DOFO混合物。在重茬田中，0.5%和50%多福合剂的用量和0.3%和50%多菌灵的剂量可降低大豆种子病的风险。

相同条件处理的HepG2 细胞收集后，用70%酒精-20 ℃下固定12 h，后用含有PI的RNase溶液进行染色，37 ℃避光培养30 min，PBS漂洗3次，用流式细胞术分析标记的细胞及使用Cell Quest Research Software分析细胞周期。

车行隧道与下卧地铁隧道施工期相互影响的研究…………………………………… 林治平，刘惠康，隋耀华（7-131）

在商业银行客户满意度的评定方面，为了反映不同指标的重要程度，对它们赋予不同的权值是否合理关系到模型最终评判的结果。层次分析法(Analytic Hierarchy Process，缩写为AHP)把评价总目标分解成各级评价指标，从高到低排成若干层次，然后对每层中的评价因素进行两两对比打分，最后通过简单的数学运算就能得到各指标所占的比例。鉴于其可操作性比较强，本文以此方法为例说明。借鉴前人的研究成果，采用目前应用较为广泛的1～9标度法[10]，对每一层次各指标间的相对重要程度进行两两比较判断，采用求平均值的方法进行数据统计，得到判断矩阵。

1.3 数据统计分析

计量数据采用均数±标准差表示，采用SPSS19.0软件进行统计学分析，通过单因素方差分析和多重比较分析不同组之间的差异，＜0.05表示差异有统计学意义。

对于我国的智能电网，从当前的使用来看，遗传算法和神经网络这两种算法得到了广泛的应用，这也让电力系统智能化能够有一个非常坚实的基础。神经网络能够对电力系统中一些复杂的非线性问题进行计算，从而解决问题，而基础为生物神经系统的人工神经网络，由于其科学化、高效化以及智能化的特点，在智能电网的应用非常的普及。同时也随着现代科学技术的飞速发展，我国对于智能电网的建设脚步也不断的加快，继电保护技术智能化的发展也越来越迅速。同时，对神经网络方法进行运用，分析系统故障的样本信息，能够在最快的之间只能发现发生故障的部位，从而对故障能够及时的进行排除，让系统的工作效率有效提升。

2 结果

2.1 DMY抑制LO2细胞脂质蓄积

2.3.1 DMY促进LO2细胞自噬体和自噬溶酶体的形成处理组的橙色荧光强度大于对照组（图2A），自噬溶酶体含量较对照组增多。TEM镜下观察发现，DMY处理后，自噬体的数量也显著增加（图2B）。

2.2 DMY对LO2细胞酶活性及脂质代谢的影响

1.2.6 细胞自噬染色检测试剂盒（MDC法）检测DMY预处理对脂肪变性模型自噬体形成的影响 100 μg/mL DMY 处理LO2 正常细胞24 h 后，使用50%FBS 造模24 h，PBS清洗1次后加入MDC染液，避光孵育15 min，Assay Buffer清洗3次，再加入1 mL Assay Buffer，置于荧光显微镜在激发波长为330～360 nm范围内，发射波长为510～540 nm范围内观察自噬体的染色荧光强度。

阳性对照组与对照组相比，TG、TC和LDL水平差异无统计学意义（＞0.05）。高FBS诱导后，LO2细胞中的TG、TC 和LDL 水平比对照组高7.8、3.9、6 倍（＜0.05，表2）。与模型组相比，DMY处理组的TC、TG和LDL水平显著降低（＜0.05），高剂量组的脂质指标水平与对照组无统计学差异（＞0.05）。恢复对照组的脂质水平较模型组略有下降（＜0.05），但仍为对照组的2.4、2.7、1.1倍（表2）。

2.2.2 DMY预处理对LO2细胞酶活性及脂质代谢影响DMY预处理组AST、ALT、LDH酶活性显著低于模型组（＜0.05，表3），且高剂量预处理组呈现更好的保护作用，AST、ALT、LDH比模型组分别下降2.0、2.6和1.1倍（＜0.05）。

DMY 预处理后TC、TG 和LDL 水平也显著降低（＜0.05），且高剂量的DMY抑制TC和TG堆积效果更好，高剂量组的TC 和TG 水平分别比模型组的下降83.8%和67.3%（＜0.05，表3）。

2.3 DMY对LO2细胞自噬的影响

与对照组比较，模型组细胞核周围分布较大的红色或橙色脂滴（图1A、1B），说明造模成功。图1C、D和E显示，DMY处理组的脂滴明显比模型组少，DMY预处理的阳性对照组（图1F），未观察到明显脂滴。恢复对照组观察到有较明显脂滴，但脂滴含量较模型组少（图1G）。

2.3.2 DMY促进LO2细胞内LC3蛋白的表达 随着处理时间的延长，LC3的表达量明显增加（图3A），在12 h处与对照组具有统计学差异（＜0.001）；LC3的表达量随着DMY干预浓度上升而上升（图3B），干预浓度为200 μg/mL（＜0.001）表达量最大。

1.2.9 HepG2细胞DNA断裂分析HepG2细胞用DMY（50、100、200 μg/mL）处理48 h，分别收集于裂解液中，37 ℃孵育30 min，后55 ℃恒温1 h；将产物溶解在含有0.25 mg/mL蛋白酶K和0.03 mg/mL RNase的溶液中。苯酚-氯仿混合液分离DNA，异丙醇纯化。70%乙醇洗涤3次后溴化乙锭染色，2%琼脂糖凝胶电泳。紫外线透射仪（Tanon 1600）下成像。

2.4 DMY通过AMPK/mTOR介导的自噬改善高FBS诱导的LO2细胞损伤

2.4.1 DMY减轻高FBS诱导的LO2细胞自噬体形成抑制 正常LO2 细胞的自噬过程处于动态的稳定（图4A1），高脂损伤导致细胞内自噬体含量下降，荧光强度下降（图4B1）。DMY预处理-FBS组细胞的荧光强度上升，自噬体的形成恢复（图4C1）。

2.4.2 DMY改善AMPK/mTOR介导的自噬通路相关因子mRNA表达 FBS诱导后，LC3的mRNA含量明显下降，而DMY预处理-FBS组细胞的LC3 mRNA含量明显上升（图5A），同时，ATG 7（图5B）和AMPK（图5C）的mRNA 含量也显著上升。而mTOR（图5D）及p62（图5E）的mRNA含量则明显下降，并且Beclin1（图5F）的mRNA含量也略有上升。

由式(7)和(8)可知点(0，0)，(1，0)，(0，1)和点 (1，1)是均衡点。令 p'=可知，当满足时，点(p'，q')也是均衡点。

①纳入标准：所有入选的患者均符合2型糖尿病的诊断标准，意识清醒，可以正常沟通，资料齐全，自愿参与本次研究。②排除标准：排除了合并存在严重脏器疾病患者以及既往存在精神病史、无法正常沟通患者，排除了资料不齐全、不配合研究的患者[3]。

2.5 DMY促进HepG2细胞凋亡

对照组没有显示清晰的DNA阶梯泳带，DMY处理组观察到清晰的DNA 阶梯泳带，泳带末端浓度随着DMY 浓度的增加而增加（图8），提示DMY 处理后HepG2细胞的DNA断裂情况增加。

除了政治经济现代化方面进行理论创新之外，我们在社会现代化、文化现代化、生态现代化、国际现代化方面也进行了理论创新，先后提出了构建社会主义和谐社会、建设社会主义先进文化、建设社会主义核心价值观、推进生态文明建设美丽中国、建设“一带一路”和构建人类命运共同体等。

2.6 DMY诱导HepG2细胞周期阻滞

DMY处理后S期HepG2细胞分布明显增加，并随DMY浓度增高而增加（图7），对照组S期细胞分布率为32.31%，高剂量DMY组的增加至70.17%（表4）。各组间G2/M期无显著差异，G0/G1期百分比随S期细胞分布率增多而降低（表4）。

2.7 DMY促进HepG2细胞DNA断裂

中剂量和高剂量DMY处理组的细胞凋亡百分比与对照组相比，早期凋亡比例无明显差异（图6），晚期细胞凋亡百分比明显增加（44.08%，57.86%4.74%）。

3 讨论

DMY是一种2,3-二氢黄酮醇化合物，是著名的药食两用植物显齿蛇葡萄中含量最丰富的黄酮物质，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤及代谢调节等作用。研究表明，DMY可以缓解油酸诱导的肝细胞脂质沉积，并具有改善NAFLD的作用，但目前其对NAFLD的发生、发展的防治机制尚不明确。

本研究首先观察了DMY干预或预处理对LO2细胞的脂质蓄积及脂质代谢、肝酶活性影响。结果显示，DMY干预高脂诱导的LO2细胞后，细胞内脂滴含量明显降低，且AST、ALT和LDH酶活性明显下降，TC、TG和LDL水平显著降低，说明DMY具有防止肝细胞损伤、抑制脂质蓄积的作用，该结果与Xie等的研究报道DMY可以降低油酸诱导的LO2细胞的TG和TC水平结果一致。研究表明，血脂水平与NAFLD的发病风险呈现正相关，降血脂、预防脂肪变性是防治NAFLD最重要的措施。本研究发现，DMY可以预防肝细胞的脂质代谢紊乱，DMY预处理24 h可以降低LO2细胞的TC、TG和LDL水平和AST、ALT和LDH酶活性，说明DMY预处理可以调节脂质代谢，缓解高脂损伤，具有保护肝细胞、预防脂脂质沉积的作用，这与之前的研究报道DMY对LPS/D-半乳糖胺（LPS/D-GalN）诱导的小鼠重型肝炎具有预防和保护效果结论相一致，而DMY预处理降低棕榈酸诱导的人胚胎肝细胞系HHL-5脂质损伤模型的氧化应激程度的结论更佐证了本研究对肝细胞的高脂损伤具有预防作用的结果。

本研究进一步基于脂噬研究了DMY的肝保护作用机制。脂噬是一种特殊的细胞选择性自噬，是正常肝细胞清除多余脂滴的重要手段。已有研究报道DMY可通过参与自噬过程缓解酒精性肝损伤并延缓脂肪变性，提示DMY可能参与脂噬修复过程。结果显示，DMY的预处理可激活LO2细胞的自噬体和自噬溶酶体的形成，进一步检测自噬关键蛋白LC3的含量，发现LC3表达量随DMY处理浓度上升而上升。本研究与相关研究报道DMY可诱导自噬体和自噬溶酶体的形成，并促进酒精性脂肪肝小鼠肝细胞LC3蛋白的表达的结论相一致。据此，我们推测DMY预处理可能通过激活自噬来防止高脂损伤。

自噬不仅影响肝细胞脂质代谢，而且保护肝细胞免受损伤和死亡。自噬的关键标志蛋白主要包括LC3，Beclin1和p62。细胞内异常信号发生时，自噬体膜上的LC3可识别脂滴上的自噬受体，通过ATG3和ATG7参与多聚泛素化反应形成自噬体，自噬体与溶酶体结合形成自噬溶酶体，将脂滴降解为脂肪酸，进入脂质代谢循环。LC3对自噬体的形成极为重要，包括LC3A，LC3B，LC3B2和LC3C 4种亚型，主要分为胞浆形式的LC3-I和膜形式的LC3-II，LC3-I可以被ATG7激活形成LC3-II，附着于前自噬体和自噬体膜上，与自噬呈正相关。选择性自噬最具特征的底物之一是p62，p62通过LC3相互作用区与LC3直接作用，随后被并入自噬体后降解，p62与自噬呈负相关。Beclin1是自噬调控的关键因子，可以调动自噬相关蛋白定位于前自噬体。AMPK是一种调节肝脏脂质代谢的重要能量传感器，mTOR是营养敏感激酶，mTOR 及AMPK 参与自噬的上游通路，AMPK可以通过mTOR抑制间接激活自噬启动子磷酸化的ULK，同时AMPK也可以直接激活ULK进行磷酸化，从而启动自噬途径。

在咱东北，桓仁、新宾到通化这一带，小孩儿要是哭、闹，不听话，大人就吓唬：“再闹，老杲子来啦!大虎杲子来啦啊！”“老杲子”这名是啥时候留下来的呢？在王杲做古埒城城主的时候留下来的。

本研究结果显示，高FBS诱导的LO2细胞自噬体的形成受到抑制，而DMY 预处理后，高FBS 诱导的LO2细胞自噬体形成抑制得到有效减轻。同时，高FBS诱导的LO2细胞的LC3 mRNA表达水平明显下降，说明其自噬通量受损，而DMY预处理后LC3、ATG7 和Beclin1 mRNA水平都明显上升，而p62mRNA水平明显下降，说明DMY具有正向调控自噬体的形成过程的作用。据报道，抑制AMPK可抑制肝脏自噬，而AMPK抑制可导致肝脏脂肪变性。结果显示AMPK mRNA水平显著上升，同时与自噬呈负相关的mTOR mRNA水平下降，说明DMY对自噬体形成的促进作用是经由AMPK/mTOR 上游通路发生的。AMPK/mTOR 介导的自噬激活是NAFLD的重要保护机制。研究表明，AMPK/mTOR介导的自噬水平在高脂饮食的小鼠和用游离脂肪酸处理的LO2细胞中都受到显著抑制，这与我们的研究结果相一致。据报道，对乙酰氨基酚可加速NAFLD的脂肪蓄积，其潜在机制可能与抑制AMPK/mTOR途径相关的自噬有关，而LRG和FNDC5改善NAFLD的主要机制是激活AMPK/mTOR介导的自噬。因此，DMY预处理极有可能是通过激活AMPK/mTOR介导的脂噬途径来改善NAFLD脂肪蓄积，从而起到保护肝细胞、预防脂肪变性等作用。

具有地方高校特色的公共数学课程教学模式改革适用于地方高校理、工、经、管、生、农等有公共数学课程的专业人才培养，包括分类分级教学、管理机制、协同共享改革、学科竞赛、自主学习模式和精品资源共享平台建设等，充分体现了因材施教和OBE教学思想，以及以学生发展为本的教学理念．

NAFLD发展可能导致多种不良的难以逆转的疾病结局，尤其是HCC。NAFLD作为代谢综合征的肝脏表现，可使肝细胞腺瘤向HCC转化。研究证实DMY不仅可以缓解高脂肝毒性症状，对HCC也有抗癌效果。细胞凋亡是抗癌药物的基本作用机制，其特征在于诱发DNA 断裂、细胞周期停滞等。有研究显示，DMY可以改变细胞周期蛋白的表达，诱导G2/M期阻滞，本研究结果提示，DMY干预可以促进HepG2细胞晚期凋亡，并诱导HepG2细胞的G0/G1期阻滞；同时，DMY 还诱导HepG2 细胞的DNA 断裂。因此，DMY可以通过诱导细胞周期停滞并诱导DNA断裂来促进HepG2细胞凋亡，这与Fang D等的报道，高良姜素、扁柏双黄酮等黄酮类物质通过诱导G0/G1期阻滞并促进凋亡发挥抗HCC的机制一致。

综上所述，本研究证实DMY可以降低高脂诱导的LO2细胞损伤程度并改善脂质代谢紊乱；DMY预处理可以促进自噬体和自噬溶酶体形成，并激活AMPK/mTOR介导的脂噬；同时，DMY可以通过诱导HepG2细胞的细胞周期停滞并促进HepG2 细胞凋亡，减缓HCC 发生。本研究首次探索DMY 可以通过激活AMPK/mTOR 介导的脂噬途径来预防NAFLD，为NAFLD防治提供新思路，并通过预防-治疗-延缓发展的思路探索DMY对NAFLD发生、发展的作用。在未来研究工作中，将进一步利用动物模型深入探讨DMY在肝脏代谢、脂质代谢中的作用及基于脂噬的防治机制，为DMY作为防治NAFLD候选药物提供科学依据。