靶向维生素D 受体的miRNA 的筛选及其对继发性甲状旁腺功能亢进患者甲状旁腺激素分泌的影响

继发性甲状旁腺功能亢进（SHPT)的发病机制至今尚未明确，目前认为是由活性维生素D受体表达降低、血钙降低，血磷升高和成纤维细胞生长因子23升高与PTH升高等多因素相互作用的结果。SHPT是慢性肾脏病（CKD）患者常见的并发症之一，CKD是一个重大的全球性的公共卫生问题，对人们疾病的发病率和死亡率具有很大的影响，其最严重的全身性问题与矿物质和激素的失衡有关，这些失衡会导致SHPT并伴有甲状旁腺(PTG)增生。CKD中的SHPT与肾性骨营养不良、骨外钙化、骨矿化受损和心血管疾病有关，SHPT加剧的矿物质代谢紊乱和心脑血管紊乱均是CKD患者死亡的主要原因。目前针对以上机制，早期SHPT的治疗主要包括维生素D受体激动剂、拟钙剂和磷酸盐粘合剂等药物治疗，然而，对于晚期SHPT患者，因药物治疗效果甚微或不能耐受手术治疗等原因，严重影响了SHPT的生存，因此，加强SHPT发病机制的研究对于延缓疾病进展和寻找治疗疾病的新方案具有重要的科学价值和临床应用前景。

维生素D受体（VDR）是一种类固醇激素受体，能调节许多生理过程，当VDR活性失调时，会导致多种疾病。VDR主要通过与活性维生素D结合产生大部分生物学效应，然后发挥其作用。在慢性肾脏病并发SHPT的过程中，甲状旁腺组织从代偿性增生发展为结节状或瘤样增生，导致了甲状旁腺细胞钙敏感受体、VDR、成纤维细胞生长因子受体1和Klotho表达下调，进一步使得PTH分泌增加和促进甲状旁腺细胞的增殖失控，从而导致SHPT 进一步加重。然而，VDR 在SHPT中下调的具体机制尚不清楚。miRNA是转录后水平上基因表达调控的重要调节因子，参与各种正常生理过程，而miRNA失调可导致细胞功能的受损和疾病进展。有学者曾提出，甲状旁腺miRNA对于SHPT的发展是必不可少的，同时可调节PTH的分泌。然而miRNA 在SHPT 中的作用尚未被广泛研究且其在SHPT中调节的证据非常有限。甲状旁腺的miRNA在甲状旁腺分泌、基因表达和甲状旁腺细胞增殖水平上对甲状旁腺功能的激活至关重要。有研究表明甲状旁腺miRNA在慢性低钙血症和尿毒症SHPT的发生发展中起关键作用。Shilo等研究结果提示某些特异性miRNA的下调影响体内和体外的PTH分泌。由此可见，在未来的研究可能将miRNA作为SHPT治疗的新靶点。miRNA通过靶向下游分子从而对疾病造成影响的研究已在多种疾病中得到证实，但在SHPT中还暂未得到证实。近年来，转录后调控机制被证明在许多疾病中发挥越来越重要的作用，为了揭示转录后调控的分子机制是否在SHPT中发挥同样重要的作用，我们试图明确miRNA是否能够调控VDR，miRNA是否通过调控VDR参与了SHPT的发生发展，这将为寻找靶向治疗SHPT提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

SHPT的甲状旁腺原代细胞为收取SHPT患者的甲状旁腺组织标本（经中南大学湘雅三医院病理科证实为甲状旁腺），利用胶原酶消化法提取获得，用于原代细胞的转染实验；正常的甲状腺旁腺组织来源于甲状腺癌需行淋巴结清扫的患者手术中误切的正常甲状旁腺组织共6例（术后经中南大学湘雅三医院病理科证实为甲状旁腺），293T细胞（上海中乔新舟生物科技有限公司）用于双荧光素酶实验。人VDR 基因3'UTR 报告载体psiCHECK-2-VDR（长沙艾碧维生物科技有限公司）；Lipofectamine3000 Reagent、Trziol Reagent（Invitrogen）；VDR 抗体（CST），PTH 抗体（Bioss），GAPDH 抗体（Proteintech）；Dual Luciferase Reporter Assay Kit（南京维诺赞生物科技有限公司）；miRNA mimics、miRNA inhibitor、miRNA NC、miRNA qRT-PCR Starter Kit、mRNA/lncRNA qRT-PCR Starter Kit、riboFECTCP Reagent及miRNA、mRNA引物（锐博生物）；免疫荧光染色试剂盒（凯基生物）；免疫组化抗原修复缓冲液、通用二步法试剂盒（小鼠/兔增强聚合物法检测系统）（中杉金桥）。标本的获取经中南大学湘雅三医院伦理委员会的批准（No:2020-S574）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 利用胶原酶消化法，将手术切除的SHPT患者的甲状旁腺剪碎后放置在1%的胶原酶中、置于37 ℃、5%CO的恒温培养箱中消化1 h，期间每隔10 min用巴氏管吹打数次，将过筛后的悬液离心（1000 r/min，5 min），离心后弃上清，用RPMI 1640完全培养基重悬离心后的沉淀，将悬液转入培养瓶后放在37 ℃、5%CO的恒温培养箱中培养，隔日观察细胞生长状态收集上清并换液，293Tcell在含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中培养。

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1.2.2 质粒构建和转染 利用miR表达载体psiCHECK-2构建psiCHECK-2-VDR对应miRNA质粒，将预测得到VDR3’UTR 与miRNA 的结合位点插入该载体中。293T 细胞接种培养于24 孔板中，次日，按照Lipofectamine3000 Reagent说明书，用Opti-MEM减血清培养基和Lipo3000 Reagent稀释miRNA mimics制备成m,用Opti-MEM减血清培养基和P3000 reagent稀释对应质粒制备成m，将m、m混匀后静置15 min后加入各对应培养有293T细胞的24孔板中，72 h后收集细胞。

1.2.3 双荧光素酶报告基因实验 将按照上述方法进行质粒和miRNA mimics共转染的293T细胞收集，用细胞裂解液裂解5 min，离心（12 000 g，2 min）后取上清备用，分别向96孔板中加入Luciferase Substrate后再取上述上清加入，读数，再向每孔中加入Renilla substrate工作液后再次读数。得到结果将海参荧光比上萤火虫荧光，并将结果进行标准化。所有实验重复3次。

1984年的大洋国就像是边沁笔下的一座全景敞视监狱：“老大哥”是坐在中心瞭望塔中的监督者，各个部门的官员和所有无产者则是每一个囚室中的被监禁者。这座“监狱”能够通过电子屏幕、窃听器、思想警察等听到看到人们的一切声音和举止，但是他们不知道自己是否正在被监视以及何时被监视。

从形态学观察刚提取种下的原代细胞散在分布，呈圆形，后细胞慢慢生长为呈多角形或梭形，传代后细胞以梭形为主且生长缓慢；培养过程中检测其PTH的分泌，可见P0及P1代原代细胞的PTH分泌相对稳定，P2代PTH分泌下降明显；将P1代原代细胞进行针对PTH抗体的免疫荧光染色，可见荧光二抗标记的PTH抗体显示绿色荧光，细胞核显示蓝色荧光（图1）。

1.2.4 甲状旁腺原代细胞的转染 利用riboFECTCP Reagent将miRNA mimics、miRNA inhibitor转染SHPT的甲状旁腺原代细胞，首先用riboFECTCP Buffer稀释miRNA mimics/miRNA inhibitor，再向上述稀释液中加入riboFECTCP Reagent，静置15 min后分别加入对应6孔板每孔中，96 h后收集细胞。

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过表达hsa-miR-149-5p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-93-3p与相应的组比较，VDR mRNA水平差异无统计学意义（＞0.05）；过表达hsa-miR-301a-5p，VDR mRNA水平增加（=0.0349，图3）。抑 制hsa-miR-149-5p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-93-3p与相应组比较，VDR mRNA水平差异无统计学意义（＞0.05，图4）。过表达hsa-miR-149-5p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-93-3p与相应组比较，VDR 蛋白表达均下降，其中以hsa-miR-149-5p 组下降最明显（图5A）。抑制hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-93-3p与相应组比较，VDR蛋白表达增加；而hsa-miR-149-5p与相应组比较，VDR蛋白表达减弱（5B）。

SHPT的甲状旁腺组织中hsa-miR-149-5p的表达水平明显高于正常甲状旁腺组织（=0.046，图8A）；SHPT的甲状旁腺组织的VDRmRNA水平明显低于正常甲状旁腺组织（=0.0267，图8B）。应用免疫组化检测了VDR蛋白在SHPT甲状旁腺组织中的表达情况，可见正常甲状旁腺的免疫组织化学染色情况示几乎所有主细胞的细胞核可见VDR阳性细胞表达，呈黄褐色，胞膜和胞浆几乎不着色，染色为强阳性（图9A）；SHPT甲状旁腺的免疫组织化学染色情况显示为VDR阳性细胞几乎未见表达，可见染色为阴性（图9B）。

我国于2011年开始实施农村土地确权登记工作，截止到目前，已经有600多个县市完成了土地测量工作，为了确保对土地测量成果的有效分析和管理，相关部门建立了城乡一体化的数据信息库，这不仅为不动产登记管理提供了便利，同时也大大提高了数据查询和服务的整体效率。在不动产登记管理过程中，由于新建房屋产权必须要进行有效登记和管理，所以不动产测绘工作重要性不言而喻。截止到目前，我国一共进行了2次大规模的房产普查，并且建立了有效的数据信息库，但是仍然有一些老旧房产没有得到登记和管理，同时对于一些小产权的房屋也没有实现登记，这就给不动产登记管理造成了严重的困扰，同时也制约了我国城市化建设的进一步实施。

1.2.8 免疫组织化学 将石蜡切片浸泡在松节油中脱蜡，分别在无水乙醇中浸泡10 min，95%乙醇浸泡3 min，75%乙醇中浸泡3 min，自来水冲洗3 min，ddHO浸泡3 min，PBS泡3 min进行水化，随后利用高压锅煮沸法进行抗原修复，并利用内源性过氧化酶阻断剂阻断过氧化酶，然后敷一抗过夜，孵二抗，利用显色液进行显色，苏木素复染，在65 ℃烤箱烤8 min脱水后封片室温过夜，显微镜下观察、拍照记录。

1.3 统计学分析

所有数据均采用Graphpad Prism 8进行统计分析，实验至少重复3次，计量资料均用均数±标准差表示，两独立样本比较采用成组检验，＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SHPT的甲状旁腺原代细胞的培养与鉴定

1.2.5 RNA提取和qRT-PCR 使用Trziol Reagent提取细胞和组织样本的总RNA；使用miRNA qRT-PCR Starter Kit试剂盒对miRNA在正常甲状旁腺和SHPT的甲状旁腺的表达进行检测实验，设置的反应程序为：95 ℃，10 min；然后40个循环分别在95 ℃，2 s、60 ℃，20 s、70 ℃，10 s，最后按照机器默认溶解曲线延伸至程序结束；使用mRNA/lncRNA qRT-PCR Starter Kit试剂盒对VDRmRNA在正常甲状旁腺和SHPT的甲状旁腺的表达进行检测实验，设置的反应程序为：95 ℃，10 min；然后40个循环分别在95 ℃，5 s、60 ℃，30 s、72 ℃，30 s至结束。使用2方法将结果分别进行归一化。每个样品设置3个复孔进行实验，引物由广州市锐博生物技术有限公司设计并合成。

2.2 靶向VDR的miRNA与其靶向关系的验证

通过生物信息学方法(http://www.targetscan.org/vert_72/)找到靶向VDR的miRNA,分别为hsa-miR-149-5p、hsa-miR-221-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-873-5p、hsa-miR-93-3p。构建psiCHECK-2 载体，其分别包含了VDR与上述7个miRNA的结合位点序列。通过双荧光素酶报告基因实验发现hsa-miR-149-5p mimics、hsa-miR-222-3p mimics、hsa-miR-29a-5p mimics、hsa-miR-301a-5p mimics、hsa-miR-873-5p mimics、hsa-miR-93-3p mimics对插入了对应VDR3’UTR片段的荧光素酶活性均有下降，而hsa-miR-221-5p mimics对插入了对应VDR3'UTR片段的荧光素酶活性上升，且结合前期本课题组对部分测序得到的上调的miRNA进行组织样本的验证，后续实验则选取hsa-miR-149-5p mimics、hsa-miR-29a-5p mimics、hsa-miR-301a-5p mimics、hsa-miR-93-3p mimics 进行。针对psiCHECK-2-VDR-149 质粒进行突变，发现hsa-miR-149 mimics 对插入对应VDR mutant 3'UTR片段的荧光素酶活性影响不明显，同时NC组对VDR3’UTR片段的荧光素酶活性影响不明显（图2）。

2.3 甲状旁腺细胞过表达和抑制hsa-miR-149-5p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-93-3p 对VDR mRNA和蛋白水平的影响

1.2.6 蛋白的提取及Western blot 利用RIPA裂解液及PMSF组成混合液来提取细胞样品的总蛋白，收集并测定各组样品的蛋白质浓度。按照说明书配制浓缩胶和分离胶，将所需样本煮沸后点样，开始电泳、转膜、并采用5%脱脂牛奶于室温封闭1 h，在4 ℃与相应一抗孵育过夜，然后与二抗室温孵育2 h，用ECL发光显色，后采用Image J进行图像分析。

2.4 甲状旁腺细胞分别过表达和抑制hsa-miR-149-5p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-93-3p 对SHPT的PTH分泌的影响

甲状旁腺细胞随着培养时间的增加PTH可先有增加趋势，但在第6天达高峰后逐渐下降（图6）。甲状旁腺细胞过表达和抑制hsa-miR-149-5p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-93-3p后对上清PTH 分泌的影响，从图中可发现过表达hsa-miR-149-5p、hsa-miR-301a-5p PTH分泌增加（图7）。

2.5 hsa-miR149-5p与VDR在SHPT的甲状旁腺组织标本中的表达

1.2.7 细胞免疫荧光 将传代后爬片后的原代细胞用4%多聚甲醛固定液固定，洗净然后用封闭液进行封闭，并在摇床上固定1 h，洗净后在玻片上滴加稀释好的一抗4 ℃过夜，第2天去除一抗并洗净，滴加适量荧光标记的二抗避光室温摇床孵育1 h，洗净后用DAPI进行核染10 min后封片，荧光显微镜下观察并拍照记录。

3 讨论

3.1 SHPT的甲状旁腺原代细胞体外培养及实验的可行性

细胞培养一直以来是生物医学和临床前研究的基础，对于大多数肿瘤疾病和常见疾病的研究我们都可以得到相对稳定的细胞系来进行实验研究，关于甲状旁腺的细胞系的研究并不成熟，而我们成功利用胶原酶消化法从SHPT患者手术切除的甲状旁腺组织提取得到甲状旁腺原代细胞进行实验，其形态与既往研究中所培养的甲状旁腺原代细胞大致相似，PTH免疫荧光染色显示阳性，同样可证明我们按前方法所提取的细胞是甲状旁腺原代细胞。我们后续实验对自己提取并培养的甲状旁腺原代细胞进行了相应的功能实验，是其他研究中未曾涉及的。研究表明肿瘤组织的原代细胞可以表现出与原发肿瘤相同的特性，且由此建立的一些细胞模型被证明是研究肿瘤形态和生物学的良好平台，可见培养原代细胞进行实验是可取的。

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3.2 VDR基因表达降低在SHPT中起着重要作用

SHPT一直与甲状旁腺VDR表达降低有着重要关系，有研究利用免疫组织化学方法检测发现尿毒症患者甲状旁腺组织VDR的密度显著下降且与增殖细胞核抗原呈负相关，另一项研究中利用RNA酶保护实验检测VDRmRNA 的表达水平发现在甲状旁腺腺瘤和SHPT的甲状旁腺组织中其表达水平均较正常甲状旁腺下降，我们的研究与上述研究中SHPT中VDR表达降低一致。既往研究只证明了增生和甲状旁腺VDR表达之间的相关性，VDR表达减少是否为甲状旁腺增生的原因还不清楚。另外有研究发现SHPT发生的变异性可能与遗传异质性有关，其中影响PTH分泌的最佳候选基因是VDR基因，但是其影响PTH分泌的具体机制不明确。VDR蛋白表达降低似乎是SHPT的一种特征性致病机制，但是其表达降低的具体机制尚不清楚。因此我们的研究进一步通过对靶向VDR 3’UTR的miRNA的筛选，发现VDR下调的机制可能与SHPT中hsa-miR-149-5p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-93-5p 的高表达存在关系，并且发现这些miRNA的过表达会使VDR基因下调从而导致PTH的分泌增加，考虑在SHPT中VDR的下调和导致PTH分泌增加的机制可能与miRNA的过表达有关。

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3.3 miRNA在SHPT中促进PTH的分泌

Shilo 等的一项在小鼠中的研究证明let-7、miR148对PTH分泌有着一定的作用。Jeong等的研究发现与miR-3680-5p相关的靶基因所参与得泛素蛋白水解途径在PTH和PTH相关蛋白的降解和蛋白水解中起作用。在最近的一项研究中，发现在CKD的SHPT小鼠的甲状旁腺中，miR-129可以负向调节促增殖、促PTH诱导的FGF23/αKlotho信号。上述研究都提示miRNA在SHPT中对PTH的分泌有一定影响，但是其具体机制尚未明确。在我们的研究中同样也证明了miRNA在SHPT中影响PTH分泌，而且我们通过在人的SHPT 的甲状旁腺原代细胞中过表达和抑制hsamiR-149-5p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-301a-5p、hsamiR-93-5p，其结果发现过表达hsa-miR-149-5p、hsamiR-301a-5p后可促进PTH的分泌，抑制上述miRNA后对PTH 分泌并无明显的抑制作用。由此可见hsamiR-149-5p、hsa-miR-301a-5p在SHPT中可能主要通过下调VDR基因的表达促进SHPT患者PTH的分泌。

3.4 miRNA通过靶向VDR在SHPT中其重要作用

迄今为止，已在人类中鉴定出许多miRNA，且人类基因中有超过三分之一是miRNA靶标，miRNA主要通过直接使靶基因mRNA降解或抑制靶基因转录后的翻译来控制基因的表达。在miR-23、miR-351、miR-1204分别在人腹膜系膜细胞、MSC成骨分化、乳腺癌中通过作用于VDR来发挥重要作用。在卵巢癌、炎症性肠病中也发现miRNA既通过直接使VDRmRNA降解又通过抑制VDR转录后的翻译来控制基因的表达。在我们的研究中发现在SHPT的甲状旁腺原代细胞中过表达hsa-miR-301a-5p后使VDRmRNA表达水平增加且有统计学意义，这与miRNA在多数情况下负调控靶基因的表达不相符，但有文献报道，miRNA可能可以上调靶基因的表达来发挥作用，因此考虑在SHPT中是否也存在某些miRNA通过上调靶基因来发挥作用有待进一步研究。在SHPT的甲状旁腺原代细胞中过表达和抑制上述miRNA后对VDRmRNA水平、VDR蛋白表达水平及对PTH 分泌的影响说明在SHPT 中miRNA可能只通过抑制转录后水平VDR蛋白的翻译，而不能通过使VDRmRNA 降解来控制基因的表达，miRNA可以与靶基因互补结合，切断靶基因的mRNA分子，从而影响下游基因的表达。miRNA也可以与靶基因不完全互补结合，进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性，抑制靶基因的翻译，且在SHPT中miRNA主要通过下调VDR基因的表达来起到促进PTH分泌的作用。由于在SHPT 中PTH 分泌的增加并不只是由于VDR基因下调这一个因素所造成，因此抑制miRNA后未能使PTH分泌降低可能是由于未能排除其他因素对PTH分泌的影响，也可能因为抑制这些miRNA后对虽然使VDR上调，但由于患者未给予相应与之结合后发挥功能的刺激，从而未能抑制PTH分泌，因此还需要更深入的研究。

综上所述，我们的研究发现miRNA可以通过靶向VDR 基因影响PTH 分泌，这可能，为早日找到治疗SHPT更好的方法提供了可能性。