甲基转移酶样蛋白27是结肠癌预后的生物标志物并与免疫浸润相关

结肠癌是消化道常见的肿瘤之一，主要发生于肠黏膜，并向邻近脏器扩散。虽然接受根治性切除术的早期结肠癌患者的5年生存率超过90%，但大多数患者被诊断为晚期或转移，导致5年生存率下降到10%。目前临床上治疗结肠癌的方法主要有手术、放疗、化疗、靶向治疗等，这些治疗方法已经取得了相当大的进展。但由于诊断晚、发展快、转移频率高，患者预后仍较差，远不能令人满意。因此，迫切需要探索结肠癌的分子机制，并确定新的生物标志物用于生存评估和靶向治疗。

近年来，m6A甲基化成为肿瘤研究的热点。随着对m6A研究的深入，发现m6A修饰在肿瘤的发生及进展中发挥重要功能。随着研究的深入，愈来愈多的m6A甲基化相关的酶被发现与肿瘤细胞的增殖、凋亡及侵袭、迁移相关。例如研究发现m6A甲基转移酶METTL3通过直接或间接上调MYC的表达促进结直肠癌细胞的恶性增殖。在此研究背景基础之上，我们发现了在肿瘤中差异表达的基因——METTL27（Methyltransferase Like 27）。METTL27（亦 称WBSCR27）是属于甲基转移酶系列的蛋白质，现有研究报道METTL27 是与Williams-Beuren 综合征相关未知功能的编码蛋白。通过对其蛋白质二级结构的研究发现，可以将METTL27 归类为I 类甲基转移酶（MTases）。然而，目前关于METTL27的生物学功能及甲基化反应未见研究，在肿瘤中发挥的作用亦尚未见报道，在结肠癌中的作用机制仍待进一步挖掘。因此，本研究旨在通过TCGA、GEO、HPA等数据库，应用生物信息学方法分析METTL27在结肠癌中的表达、临床相关性及生存预后相关性。使用GSEA 富集分析挖掘METTL27可能参与的信号通路，揭示其在结肠癌中发生发展中的分子机制，希望提供一种新的候选基因来改善结肠癌的预后和生存率。

1 资料和方法

1.1 生物信息学分析资料获取

TCGA数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载结肠癌项目（结肠癌）中的高通量测序RNA数据（每百万千碱基片段（FPKM）格式）和对应的临床病理信息数据。在这项研究中，RNA测序数据从FPKM格式转化为每百万次读取的转录本（TPM）。研究方式完全按照TCGA指南进行，所有的伦理相关知情同意都是在数据收集之前获得的。

如上述，巴基斯坦在抗震设防的区划与中国类似，很容易将其与中国的动参数区域相对比，并采取相应的抗震设防烈度，并按照规范采取相关抗震设防参数。印度尼西亚、委内瑞拉等国业与其较为类似。

GEO数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）是由美国国立生物技术信息中心创建并维护的基因表达数据库。纳入标准的数据集应包括结肠癌样本组和对照样本组（健康组织、相邻的非癌组织），每组至少包含10个样本。最后选择纳入GSE83889以及GSE164191两个基因表达谱。

分析使用软件：R（3.6.3版本）用于数据归一化，并统计分析与可视化。

Human Protein Atlas 数据库（https://www.proteinatlas.org/），即HPA数据库，是一个免费的包含超过26 000种抗体，靶向来自17 000多种人类基因的公共数据库。通过检索基因METTL27得到正常结直肠组织以及结直肠癌组织免疫组化样本。

1.2 整合差异表达基因（DEGs）筛选并构建PPI网络

将METTL27（cut-off value of 50%）分为低表达和高表达组，整合项目中level3 HTSeq-Counts格式的RNAseq数据，使用R包：DESeq2（1.26.0版本）用来鉴定DEGs，通过R包：ggplot2（3.3.3版本）进行热图可视化展示。通过STRING数据库（https://cn.string-db.org/）分析METTL27蛋白列表中的分子互作情况构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI），并展示蛋白网络互作关系，R包：igraph 进行可视化。

广西地不容为濒危物种，狭域分布[5]。2012—2016年连续5年，本课题组对文献和标本馆查询到的广西地不容分布区进行了实地调研，结果表明该物种资源仍进一步衰减；原有的一些产区已经很难寻到野生样品或者只有零星的个体，难以在群体水平上进行采样，比如广西凌云县、田林县、田东县和德保县。因此，对于广西地不容，在较大区域范围采集到群体水平的样品已十分困难，本实验以个体数量相对较多的5个居群评价其遗传多样性。

1.3 METTL27功能注释和KEGG通路分析

对METTL27 进行基因GO功能注释和京都基因与KEGG 通路富集分析。统计分析和可视化均在R3.6.3版本中进行。Cluster Profiler（3.14.3版本）包用于富集分析,ggplot2包用于可视化。

1.4 METTL27差异基因集富集分析（GSEA）

在本研究中，使用R包clusterProfiler进行GSEA，以阐明高METTL27组和低METTL27组之间的显著功能和通路差异。数据集来源于MSigDB数据库（https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp）调整后的dp＜0.05、错误发现率（FDR）＜0.25 和标准化富集评分（|NES|）＞1被认为是显著富集。

1.5 METTL27免疫浸润相关性分析

使用R包：GSVA中的ssGSEA算法对METTL27进行免疫浸润分析。共获得24种浸润性免疫细胞。采用Spearman校正法分析METTL27与24种免疫细胞富集评分的相关性。采用Wilcoxon 秩和检验分析METTL27高表达组和低表达组的富集评分。

我们分析了METTL27在不同临床病理特征的患者中的表达。其中，N期N1、N2期（图5B，=0.016），病理分期为III、IV 期（图5D，=0.026），发生淋巴转移（图5E，＜0.001），BMI≥25（图5F，=0.015）的患者METTL27表达显著升高；T分期（图5A）与M分期（图5C）表达水平差异不具有统计学意义（＞0.05）。此外，Logistics analysis分析了METTL27表达与临床病理特征之间的相关性（表1），结果显示METTL27高表达在临床晚期、淋巴转移、BMI 指数具有高风险比，与其mRNA表达水平保持一致。

1.6 结肠癌中METTL27表达与临床病理特征的相关性分析

采用Wilcoxon秩和检验（连续变量）或Pearson卡方检验比较METTL27高、低表达组的临床病理特征。通过Logistic分析评价METTL27表达与临床病理特征的相关性。

1.7 结肠癌中METTL27表达的临床意义

更为重要的是，区县级电视台在制作专题节目时，往往存在创新意识不强、缺乏优创的弊端，相关采编人员的能力和素质都有待提高，业务水平不高、责任心不强的现象也比较常见，这需要在后续工作中努力加强。

1.8 16例临床样本收集及Western blotting实验

收取癌组织及癌旁组织，所有临床样本均按照离体40 min内经液氮速冻后保存于液氮罐的标准进行保存，所有用于总RNA提取的组织样本都已添加RNA保护剂。所有样本在收集前通过本单位伦理委员会批准及患者知情同意，符合指南规定。纳入收入的标本已临床病理诊断确诊为结直肠癌。

（4）在员工对“生态与人文环境保护”满意度评价中，本文依据文献，设计出如下二级评价指标：企业环境保护态度（U341）、企业生产中环境保护措施（U342）、企业参与社会生态环境计划（U343）。

提取蛋白之后，BCA法测定上清浓度，变性后置于冰上，配制10%浓度的PAGE凝胶后进行电泳，电泳结束后转膜封闭，加入Fine test METTL27 一抗（CAT：FNab10887）；Proteintech β-actin 一抗（CAT：66009-1-Ig）过夜（1∶1000），洗膜后加入对应兔、鼠二抗（1∶2000），室温孵育2 h后加入ECL化学发光液，使用Bio-Rad化学发光仪进行曝光，显影。

1.9 细胞培养与qPCR实验

人肠上皮细胞NCM460 于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基培养，人肠癌SW480、SW620、HCT116 均于10%胎牛血清的高糖DMEM 培养基培养，37 ℃、5%的CO、95%湿度培养箱中孵育培养，待细胞密度达到80%时进行RNA提取；RNA提取试剂盒（Mabio，RNT412-02），逆转录试剂盒（Vazyme，R222-01），ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 试剂盒（Vazyme，Q711-03）。引物（上海捷瑞），细胞均由广东医科大学中美肿瘤研究所提供。

引物序列：

5'-CTACCTCATGAAGATCCTCACCGA-'（β-actin,Forward）；5'-TTCTCCTTAATGTCACGCACGATT-3'（β-actin,Reverse）；5'-CAGGCCCGCCCCACAGT-3'（METTL27,Forward）；5'-GGCTCCCATCCACCCCA-3'（METTL27,Reverse）。

通过受试者工作特征（ROC）分析，比较结肠癌肿瘤与癌旁组织中的表达，检验METTL27对结肠癌诊断的预测价值。结肠癌患者的临床预后信息包括总生存期（OS）、疾病特异性生存期（DSS）。采用Kaplan-Meier分析、单因素和多因素Cox回归分析进行预后分析。R包：survival（3.2.10版本）用于生存资料的统计分析。使用R包：rms构建列线图和校准图，并进行分析及可视化。

1.10 统计学分析

采用GraphPad Prism 8（GraphPad Software）进行数据统计分析。Western blotting以及RT-PCR反应实验，检验前进行方差齐性检验，若方差齐，采用检验，方差不齐，采用检验。未配对的双尾测试用于比较两组数据。参数比较采用卡方检验和秩和检验。Spearman相关分析用于评估变量之间的相关性。采用单变量Logistic回归分析METTL27的表达水平与临床特征的关系。＜0.05时认为差异具有统计学意义。

TCGA数据库中显示METTL27 mRNA水平在在不同肿瘤中高表达。在33种肿瘤类型中，METTL27在21 种肿瘤中显著高表达，尤其是胃肠道肿瘤中（图1A～B）。更具体地说，在结肠癌肿瘤中METTL27的表达明显高于癌周组织，配对样本肿瘤中METTL27亦较正常表达更显著（＜0.001，图1C～D）。

2 结果

2.1 METTL27在结肠癌和其他肿瘤中的表达

训导他们的人是老崔，老崔是物业经理，这些日子，停车事件频频发生，有涵养的老崔嘴上起泡，心里长毛，天天在小区里东转西转，眼睛东瞄西扫，恨不得到哪里发现一块新大陆。他的副手还带着保安在背后嘲笑他，说，这个小区有什么转头的，老崔这是找车位呢，还是找老鼠洞？

2.2 结肠癌中METTL27在TCGA差异表达基因及共表达基因

ROC曲线来证明METTL27在鉴别结肠癌诊断中的价值。结果显示曲线下面积（AUC）为0.806，METTL27诊断结肠癌具有明显的高敏感性和高特异性（图6A）。K-M分析验证了METTL27对临床生存的预测，如图6 B-C所示，在总生存率（危险比HR:2.18,＜0.001）、疾病的具体生存期（HR:1.92,=0.012）具有统计学意义，METTL27高表达的结肠癌患者的预后较表达低的更差。单因素的Cox回归分析（表2）结果显示：METTL27高表达在临床不良预后因素中具有更高的风险。在进一步的多因素Cox回归分析中显示（表3），METTL27表达是总生存期（HR：2.908，=0.049）的独立危险因素，对疾病的具体生存期无显著预测能力。但是，在多因素Cox回归分析中，临床分期，尤其是临床M期和病理分期对临床结果也具有预测优势。通过将临床TNM，病理分期，脉管、淋巴侵犯等临床预后因素纳入列线图，并构建预后列线图，并绘制校准曲线来测试列线图的有效性。结果显示：结肠癌总生存期中其Cindex为0.787（图6D），疾病特异性生存期预测C-index为0.882（图6E）。校正曲线显示均对1年、3年、5年临床结果的3个列线图进行了理想的预测（图6E、G）。

2.3 METTL27功能注释富集分析及构建蛋白PPI网络

通过鉴定差异基因进行了包括3类GO功能注释分析：生物过程（BP），CC和分子功能（MF），以及KEGG途径富集分析。如图3A所示，BP功能富集结果包括：离子跨膜转运的再调节、表皮细胞分化、脂质转运、脂质分解代谢过程、钾离子转运；CC功能富集结果：跨膜转运蛋白复合物、离子通道复合体、蛋白质-DNA复合物、DNA包装复合物、阳离子通道复合体；MF富集结果：被动跨膜转运蛋白活性、底物特异性通道活性、酶抑制剂活性、生长因子活性、铁离子结合。图3B中KEGG信号通路结果显示：神经活性配体-受体相互作用、CAMP信号通路、钙信号通路、味觉传导、胆汁分泌、PPAR信号通路、类固醇激素生物合成、胆固醇代谢、脂肪消化吸收、尼古丁成瘾。图3C显示通过构建PPI蛋白互作网络，与METTL27 相关的前十互作蛋白：BCCIP、BYSL、DDX55、FTSJ3、KRR1、LTV1、NIP7、NOB1、RPF1、TRMT112。图3D显示通过对差异基因分析，GSEA识别与METTL27相关的信号通路包括：白介素17信号通路、化学渗透偶联法生成ATP、MHC信号通路、DNA甲基化、PRC2使组蛋白和DNA甲基化。

2.4 结肠癌中METTL27免疫功能相关性分析

通过对结肠癌中METTL27免疫浸润水平分析发现，METTL27 与多种免疫细胞具有相关性。METTL27 与NK CD56bright cells 呈正相关关系（图4A，R=0.268，＜0.001），与T helper cells（R=-0.261，＜0.001）、Tcm（R=-0.19,＜0.001）、Th2 cells（R=-0.215，＜0.001）细胞呈负相关关系。更进一步将METTL27分为高低表达组后，NK CD56bright cells（图4B）、T helper cells（图4C）、Tcm（图4D）、Th2 cells（图4E）浸润水平和图4A保持一致。

2.5 结肠癌患者中METTL27表达与临床病理特征的相关性分析

3.3.4 元数据采集入库。对平台中的元数据，包括平台中心前置库、汇集库、基础库、业务主题数据库等库表结构和数据资源的元数据进行统一的抽取、存储和装载入库，支持元数据的手工录入。

2.6 结肠癌患者中METTL27表达与临床预后意义分析

差异分析以火山图展示|log2（FC）|＞1&p.adj＜0.05阈值下的分子数目。火山图显示满足|log2（FC）|＞1&p.adj＜0.05 阈值的ID 有3960 个，在这阈值下，高表达（logFC为正）的数目有79个，低表达（logFC为负）的数目有3881个（图2A）；共表达热图显示了与METTL27正负相关的前十基因（图2B）。

2.7 METTL27的表达水平在GEO、HPA数据库中的验证

如图7A所示，HPA数据库中发现METTL27蛋白在结肠癌组织中存在较明显的高表达。HPA数据库中免疫组织化学染色显示与正常组织相比，癌组织免疫组化染色更深，提示METTL27蛋白在结肠癌组织中存在较明显的高表达；图7B结果：GEO数据库GSE83889数据集以及GSE164191数据集均显示，与正常组织相比，METTL27在结肠癌中表达水平明更高。

2.8 qPCR在不同肠癌细胞株及16例肠癌组织中验证METTL27表达水平

如图8A，培养人肠上皮细胞NCM460，以及人肠癌SW480、SW620、HCT116、CACO2、RKO、LOVO细胞，验证其相对于正常肠上皮细胞的表达水平，发现在大多数肠癌细胞中METTL27表达水平高于正常NCM460细胞。同时，收集16例确诊为肠癌的患者配对肠癌组织，如图8B结果显示：在16例配对的肠癌组织中，其中11对METTL27表达水平高于正常，其余5例无差异，未见有肠癌中METTL27表达水平低于正常组织（NATs：癌旁组织；Tumor：肠癌组织）。

2.9 Western blot实验在不同肠癌细胞株及4例肠癌组织中验证METTL27表达水平

同样的，我们在不同肠癌细胞株以及组织标本中验证了METTL27的表达水平。结果显示：在不同肠癌细胞株中，相对于NCM460细胞，SW480、SW620、HCT116、CACO2、LOVO 细胞METTL27 表达均高于正常，而在RKO 细胞中低于正常细胞，总体而言，METTL27在大多数肠癌细胞的表达水平高于正常细胞（图9A）。同时，在配对的4例肠癌组织中（N：NATs；T：Tumor），METTL27蛋白水平表达明显高于癌旁配对组织（图9B）。

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1.直接接触型：如直接出现在被害人面前，被害人得以当面面对行为人，而行为人经拒绝后仍不间断、持续跟追或纠缠被害人，后续甚至可能对被害人做出碰触或攻击行为。直接接触型的跟追纠缠行为，可能为直接对被害人作出恐吓行为、更进一步对被害人作出财产甚至人身攻击行为，当然亦可能对被害人周遭熟识者为之。

3 讨论

以往的研究对于METTL27是缺失的，现有的研究仅报道了其在Williams-Beuren 综合征中的作用。而在本研究中，我们首次报道了METTL27在肿瘤中的表达及作用，旨在通过分析TCGA-结肠癌数据集，重点关注结肠癌中甲基转移酶METTL27的表达谱、临床病理相关性和临床意义。在TCGA数据中，METTL27在大多数肿瘤中显著过表达。这些结果表明METTL27有潜力成为各种癌症的诊断标记。我们发现在结肠癌肿瘤中METTL27表达显著增加，这一结果也在GEO（结肠癌数据集GSE83889、GSE164191）以及HPA数据库得到证实，METTL27的表达在结肠癌中可能是一个很好的诊断标志物，其AUC超过0.8。此外，我们还发现METTL27与结肠癌的临床N分期、病理分级、淋巴转移、BMI指数相关，并具有高风险比（HR＞1），进一步证实METTL27的表达可能与结肠癌的恶性程度有关。从生存数据来看，METTL27 mRNA高表达的患者OS、DSS较差，进一步的Cox回归分析显示，METTL27表达是OS的独立预后因素。此外，列线图以及校准曲线显示，METTL27 对结肠癌进行了理想的预测。METTL27的普遍上调和预后预测结果表明，它是一个极具潜力的结肠癌预后标志物。进一步通过实验验证了METTL27的表达水平，与生物信息学预测结果保持一致，METTL27在肠癌组织中表达明显高于正常组织。

WBSCR22被鉴定的蛋白质是S-（50-腺苷）-l-甲硫氨酸（SAM）依赖的rRNA甲基转移酶，蛋白是核糖体前RNA加工所必需的，并介导人类18S rRNA中G1639的N7 甲基化。蛋白METTL27（WBSCR27）与WBSCR22具有较高的同源性，序列生物信息学分析表明该蛋白也属于甲基转移酶家族。然而，与WBSCR22相比，METTL27的确切生物学功能仍不清楚。因此，基于我们认为METTL27在结肠癌中是一个不良的风险因子，为了更好地理解其在结肠癌中的潜在功能，我们鉴定了METTL27的差异表达基因，初步对其进行了基因功能注释，发现METTL27在跨膜物质转运以及脂质代谢进程中显著富集。脂质代谢在肿瘤进展中发挥着重要的角色，肿瘤进展过程中，肿瘤微环境中营养物质的可用性不断变化，因而肿瘤细胞利用脂质代谢来维持其快速增殖，存活，迁移，侵袭和转移。而在GSEA识别的5条信号通路上，白介素17信号通路近年备受关注，IL-17是一种由活化的T细胞分泌的促炎细胞因子，已被证明可以促进胃癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤的发生。另外，GSEA识别的另一条信号通路——MHC（主要组织相容性复合物）信号通路，对于此生物标志物，越来越多的研究表明多种癌症类型中，MHC I类和II类的表达可能是指导免疫检查点抑制剂治疗的有用生物标志物。Paula等认为在早期HER2阴性的乳腺癌中，MHC-II表达比PD-L1表达更能预测对免疫检查点抑制剂的反应。MHC-I类和II类作为生物标志物都很重要，这主要取决于我们选择的免疫治疗反应（或方案）的哪个阶段作为免疫检查点抑制剂的治疗靶点。因此，MHC分析是免疫联合治疗一个新的方向。在另一个识别的GSEA通路中，显示METTL27可能在DNA甲基化以及PRC2（多梳蛋白抑制复合物2）介导的组蛋白和DNA甲基化中发挥作用。在正常黏膜向腺瘤，息肉向肿瘤的进展过程中，可以显而易见地看到发生甲基化的基因大幅增加。Esteller研究发现结直肠腺瘤中MGMT、MLH1等DNA修复基因的异常甲基化可能促进腺瘤发生恶变。PRC2，可对H3K27三甲基化（H3K27me3），是肿瘤发生发展的一部分，PRC2癌症中的关键作用使它成为表观遗传学癌症治疗的治疗靶点。结合以上的研究结果及国内外认识，肿瘤的发生发展是多方面因素决定的，是一个多步骤参与的复杂过程，而对于METTL27功能以及通路研究的发现有助于揭示其在结肠癌中的作用和加强对结肠癌发生发展机制的了解。

除此之外，我们还分析了METTL27表达与免疫细胞浸润之间的潜在关系。METTL27表达与辅助T细胞、辅助T细胞2型、中央记忆型T细胞呈负相关关系。T 辅助细胞在炎症性肠病的发病机制中起关键作用，可促进炎症性肠病和结肠炎相关结肠癌发病机制中的炎症反应。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-10、IL-13，促进体液免疫。Th1/Th2比例降低可通过相关细胞因子分泌异常，促进肿瘤生长，同时增强肿瘤免疫逃避功能，促进肿瘤转移和进展。目前Th1/Th2比例失衡在肿瘤发生及进展中作用机制尚不明确，仍需要进一步研究。多项研究表明，与效应记忆T（Tem）细胞和效应T（Teff）细胞相比，中央记忆（Tcm）T细胞显示出优异的持久性和抗肿瘤免疫能力。我们希望揭示驱动记忆T细胞形成的分子途径，这将对发展优化癌症免疫治疗的合理方法至关重要。

综上所述，我们首次报道了METTL27在肿瘤中的表达水平，并分析推测了其在结肠癌中的潜在预后价值，METTL27可能具有极大潜力作为诊断结肠癌的肿瘤标记物。高METTL27表达显示了低免疫细胞浸润，而且对于基因本身的功能和具体的信号通路我们也做出了一定的预测，但是这些结果仍需要一系列的实验进行验证。总之，METTL27可能是一种新的结肠癌预后预测因子，进一步的机制研究可为结肠癌的早期诊断以及发生发展机制提供新的靶点。

银行信息技术管理作为一项比较复杂的工作，其所涉及的范围比较广泛，并且具备有一定的管理难度。针对这一问题，也就要求各银行能够对信息管理的重要性有一个清晰的认知，并且能够积极运用信息化技术来提升自身的管理水平跟业务服务水平，这样才能够促使银行自身的市场核心竞争能力得到进一步的提升，并提升其在国际市场上的竞争水平。