双mTORC1/2 抑制剂AZD2014 可抑制大鼠肝移植后的急性排斥反应

哺乳动物中雷帕鸣的靶蛋白mTOR是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，在进化过程中高度保守，可在多种因素的活化下参与细胞的增殖、凋亡、血管生成和自噬等生物学功能。mTOR可以和不同的蛋白结合形成mTOR复合物（mTORC）。在生物体内mTORC至少以两种形式存在：mTORC1 和mTORC2。mTORC1 由mTOR、Raptor、FKBP12、PRAS40和mLST8等蛋白组成，对雷帕鸣敏 感，mTORC2 由mTOR、Rictor、Sin1、Protor 和mLST8等蛋白组成，对雷帕鸣不敏感。目前的研究认为，雷帕鸣及其衍生物不能完全地抑制mTORC1的活性，对mTORC2无效，同时可反馈性地激活AKT信号，是影响其生物学作用的主要原因。因此，科学家们希望能够研发一种既可以阻断mTORC1 信号，同时又可以阻断mTORC2信号的新型双mTOR抑制剂。AZD2014 正是这类新型mTOR 抑制剂中的佼佼者。

既往研究已证实，mTOR信号通路在免疫调节中具有重要的作用，传统的单mTORC1抑制剂雷帕鸣是临床上移植术后常用的免疫抑制剂。另一方面，前期我们已经证实双mTOR抑制剂AZD2014对肝细胞癌具有显著抗癌作用。而肝癌肝移植术后长期应用免疫抑制剂理论上会增加肝癌的复发率。所以如果AZD2014同时具有抗癌作用和抗排斥作用，便可以抑制肝癌肝移植术后的急性排斥反应的同时降低肝癌的复发风险。但是双mTORC抑制剂AZD2014是否具有抑制肝移植术后急性排斥反应的作用尚不清楚。基于以上原因，我们利用同种异基因大鼠肝移植模型来验证双mTORC1/2抑制剂AZD2014是否具有抑制肝移植术后急性排斥反应的作用。

1 材料和方法

1.1 大鼠

雄性Lewis大鼠和Brown Norway (BN)大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，7～10周龄，体质量180～220 g，饲养于南方医科大学南方医院动物实验中心，SPF级，每天12 h光照/12 h黑暗的昼夜循环，动物可自由地进食和饮水。

1.2 主要试剂和器械

AZD2014（Selleckchem），乙醚（中国广州市化学试剂厂），聚乙二醇（Sigma），Tween 80（Sigma），林格氏液、10%葡萄糖溶液（中国上海百特医疗用品有限公司），肝素钠注射液（中国齐鲁制药有限公司），哌拉西林钠/他唑巴坦（中国华北制药股份有限公司），苏木素、伊红（中国谷歌生物），PV-9000通用型二步法免疫组化检测试剂盒（中国北京中杉金桥公司），正常山羊血清封闭液（中国武汉博士德公司），大鼠CD3多克隆一抗，大鼠Foxp3多克隆一抗（中国谷歌生物）。显微外科手术放大镜（Leica），显微外科直镊、弯镊、弯剪、持针器、血管夹（中国上海医疗器械集团有限公司），全自动生化分析仪（BECKMAN），普通正置显微镜（OLYMPUS），生物组织自动脱水机，组织烤片机（Thermo），石蜡切片机（Leica），自动双重纯水蒸馏器（Millipore），8-0、9-0 prolene血管缝线（爱惜康）。

1.3 实验分组和建模

采用Kamada 提出的“二袖套”法建立Lewis→BN同种异基因大鼠肝移植急性排斥反应模型。术后将BN大鼠随机分成2组（对照组和AZD2014给药组），4只/组。AZD2014给药组每天腹腔内注射AZD2014药物，5 mg/kg体质量，1次/d；对照组每天腹腔内注射药物溶剂（PBS 液含2%聚乙二醇，0.2%Tween 80，0.5%DMSO）2.5 mL/kg体质量，1 次/d。受体BN大鼠分别于术前第3天和术后第1、3、5、7、10、14天收集血清标本，全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和总胆红素（TBIL）。观察终点：大鼠死亡或术后生存时间≥14 d，记录生存时间，进行生存分析。观察终点出现后，收集移植肝脏。移植肝脏行免疫组化检测CD3和Foxp3的表达水平，评估移植物中T淋巴细胞和Treg细胞浸润的程度；移植肝脏行HE染色，采用Banff方案评估肝移植术后的排斥反应。所有动物实验均已通过南方医科大学动物实验伦理委员会批准，所有操作符合动物伦理要求。

对照组移植肝脏内有大量成团聚集的炎性细胞浸润（图3A）；而AZD2014组仅有少量散在的炎性细胞浸润（图3D）。图3B和图3E分别显示对照组和AZD2014组移植肝内一个典型的肝小叶结构，可以看到对照组的汇管区和中央静脉周围有大量炎性细胞浸润，而AZD2014组的汇管区和中央静脉周围未见明显的炎性周围有大量炎性细胞浸润，中央静脉周围有大量炎性细胞浸润，管腔变形，可见部分内皮细胞脱落（图3C）。而AZD2014组的汇管区主要以少量淋巴细胞浸润为主；中央静脉形态正常，内皮下未见明显炎性细胞浸润，周围肝实质有少量散在淋巴细胞浸润（图3F）。根据Banff方案进行排斥反应指数评分，结果见图4。

1.4 苏木素-伊红（HE）染色

这封信后来被潘际銮当作钻石婚纪念相册的扉页。每次翻及，潘际銮都会大笑，而李世豫则会腼腆地低头：“他十多岁就在炮火声中四处逃难，后来流亡到昆明，进了西南联大。他知道强国必须强工业，自此就把自己同国家的命运焊接在了一起。”

1.5 免疫组化染色

采用SPSS13.0统计软件进行分析，所有检验方法均采用双侧检验，假设检验水准α=0.05。两组间均数比较采用两独立样本的检验。移植术后两组间生存率的计算采用Kaplan-Meier法，两组间生存率的比较采用log-rank法。两组间不同时间点重复测量的数据采用两个重复测量因素的方差分析。

术后第1天，对照组和AZD2014组中血清ALT和AST均较术前显著升高（图2A、B）。术后第3天，对照组血清ALT和AST水平略有下降，但之后又迅速进行性地升高，并维持在高水平状态（图2A、B）；而在AZD2014组中，术后3 d内血清ALT和AST迅速下降，并持续维持在低水平状态（图2A、B）。对照组中的血清TBIL在术后前5日维持在低水平状态，但从术后第5天开始迅速进行性升高，并维持在高水平状态（图2C）；而AZD2014组中的血清TBIL始终维持在低水平状态（图2C）。因此，从肝损伤的角度来看，AZD2014可以显著减轻同种异基因大鼠肝移植术后肝细胞的损害（＜0.05）。

1.6 统计学处理

按1.4所述方法准备组织切片；采用高压法修复组织抗原；3%的HO溶液灭活内源性过氧化物酶；山羊血清封闭溶液，室温下封闭20 min；滴加少许（以能覆盖组织切片为准）相关抗体（抗体的稀释比例以各自说明书以准），4 ℃冰箱中孵育过夜；次晨，切片复温后，从PV-9000二步法免疫组化检测试剂盒中取出试剂1（增强剂），滴加少许，室温下孵育20 min；再从PV-9000二步法免疫组化检测试剂盒中取出试剂2（通用型抗鼠/免二抗），滴加少许，室温下孵育30 min；DAB显色液显色；苏木素染色后，将组织切片置于梯度酒精中脱水，酒精浓度依次为75%、85%、95%、100%(I)、100%(II)，每梯度脱水5 min；二甲苯透明及封片。

2 结果

2.1 AZD2014对肝移植术后2周内大鼠生存率的影响

术后1周内，两组大鼠的精神状态、活动能力和对外界刺激的反应无明显差别。对照组在术后第8天，开始出现毛发蓬松，精神状态、活动能力和对外界刺激反应下降的现象，术后第9天开始有大鼠死亡，术后14 d内有3/4 的大鼠死亡；而AZD2014组在整个观察期（14 d）内大鼠的精神状态和活动能力良好，对外界刺激反应灵敏，但进食量较正常大鼠下降（可能与药物的副作用有关），术后14 d内4/4大鼠存活。肝移植术后两组大鼠术后生存分析见图1（χ=4.213，=0.040）。细胞浸润。对肝小叶结构进一步放大，发现对照组的汇管区内呈混合炎性细胞浸润，包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞、浆细胞和淋巴细胞，并且炎症向周围肝实质扩散；小叶间胆管周围有大量炎性细胞浸润，炎性细胞侵入胆管基底膜内侧，部分胆管上皮细胞出现核旁空泡变性，部分胆管上皮细胞排列紊乱；小叶间静脉

2.2 AZD2014对肝移植术后大鼠ALT、AST和TBIL的影响

高中化学的主要研究内容是从微观的角度研究物质的成分、性质及规律，这在一定程度上决定了化学知识的抽象难懂，导致学生对化学学习充满畏惧心理，不愿意主动配合教师的教学活动，而对于强调逻辑思维和动手能力的化学实验更是敬而远之，导致在化学实验教学中学生的参与性较低，不利于化学实验的有效开展，也不能有效提高学生的科学实验探究能力。

2.3 AZD2014对大鼠肝移植术后移植肝脏病理学的影响

儿童FC主要基于典型的病史和体格检查做出临床诊断，一般不需要其他理化检查。其诊断标准，建议采用罗马Ⅳ标准（以4岁为界分为婴儿/幼儿 FC 和儿童/青少年 FC）［1］、《巴黎儿童便秘术语共识》（PACCT，没有年龄限制）［8］等。

(3) 在排水管壁试样面积大小、水力梯度一致的情况下，与残积砾质黏性土相比，残积砂质黏性土的单位体积含土量增长了20%～36%，残积粉质黏性土的单位体积含土量增长了43%～73%，排水管壁试样单位体积含土量随着土体中黏粒含量的增大而增大，且增大幅度较其他两种变量大。

对移植肝脏进行免疫组化染色发现，对照组移植肝内炎性细胞浸润区域有大量的T淋巴细胞（CD3阳性）浸润（图5），但仅有少量散在的Treg细胞（Foxp3阳性，属于免疫抑制细胞）浸润（图6）；而AZD2014组的结果则正好相反，与对照组相比，AZD2014组移植肝内Treg细胞浸润的数量显著增多（图6），但T淋巴细胞浸润的数量则显著下降（图5）。病理检查结果证实对照组的移植肝脏出现了严重的急性排斥反应，而AZD2014给药组的移植肝脏未见典型的排斥反应的病理改变。

将移植肝切成大小约0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的组织块，4%多聚甲醛固定24 h，流动自来水冲洗3 h；放入梯度酒精中脱水，酒精浓度依次为75%、85%、95%、100%(I)、100%(II)，每个梯度脱水45 min；浸泡于二甲苯I和二甲苯II中，各30 min；浸蜡、包埋、切片、捞片、烤片、脱蜡和水化；切片置于苏木素水溶液中染色5 min，流水洗去苏木素1 min，再置于1%盐酸酒精中3 s，稍水洗2 s，自来水中返蓝10 min，蒸馏水洗1 min；切片置于0.5%伊红染液中2 min，而后用蒸馏水洗2 s；切片置于梯度酒精中脱水，酒精浓度依次为75%、85%、95%、100%(I)、100%(II)，每梯度脱水5 min；二甲苯透明及封片。

3 讨论

mTOR信号参与淋巴细胞的激活及免疫因子的合成，阻断mTOR信号后，可以使淋巴细胞发生G1/S期细胞阻滞，阻断淋巴细胞分裂，进而发挥免疫抑制作用。传统的单mTORC1抑制剂雷帕鸣是临床上移植术后常用的免疫抑制剂。近年来随着对mTORC2的深入研究，发现mTORC2信号在免疫系统的调节过程中也发挥着重要作用。因此，我们想了解双mTORC1/2抑制剂AZD2014是否也具有抑制肝移植术后急性排斥反应的作用。在我们的研究中发现，AZD2014可以显著提高移植受体的存活率（AZD2014组术后14 d的存活率为4/4，而对照组的大鼠术后14 d的存活率为1/4），术后肝功能的检测和移植肝脏的病理检查也证实AZD2014可以有效地抑制同种异基因大鼠肝移植术后的急性排斥反应。这一结果与Rosborough 等使用mTOR抑制剂AZD8055抑制小鼠移植心脏急性排斥反应的研究相一致。

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mTOR抑制剂能够发挥免疫抑制作用的重要机制之一是诱导T淋巴细胞发生G1/S期细胞阻滞，抑制效应性T 淋巴细胞的增殖。调节性T 淋巴细胞（Treg）是免疫系统中重要的调节细胞，可以抑制效应性T淋巴细胞的功能，在诱导和维持移植免疫耐受中起着重要的作用。抑制mTOR信号可以促进Treg细胞的生成、增殖，增强其免疫抑制功能并维持表型的稳定性。本研究中，我们对术后肝功能的检测和移植肝脏的病理检查也证实AZD2014可以有效地抑制同种异基因大鼠肝移植术后的急性排斥反应。进一步检测移植肝脏Foxp3（Treg细胞的重要分子标志）和CD3（T细胞的重要分子标志）的表达水平，我们发现AZD2014可以显著增加Foxp3的表达，同时抑制CD3的表达。有研究发现抑制mTORC1/2信号后T淋巴细胞无法分化为Th1、Th2或17效应细胞，但可保留向Foxp3Treg的分化的能力。这些发现与我们的研究结果相一致，说明双mTORC1/2 抑制剂AZD2014 抑制排斥反应的机制与诱导Treg细胞生成和抑制T淋巴细胞增殖有关。

肝移植是治疗肝细胞癌的重要措施之一，具有其它治疗方法无法比拟的优点。特别是符合“米兰标准”的肝细胞癌患者，接受肝移植治疗后，4年的存活率可高达85%，而且复发率低于15%。肝移植术后，需要长期应用免疫抑制剂，在某种程度上来说会增加肝癌的复发率。我们前期研究发现AZD2014对肝细胞癌具有抗癌作用。本研究我们又发现AZD2014可以抑制肝移植术后急性排斥反应的作用。即AZD2014同时具有抗癌作用和抗排斥作用。因此，我们认为肝癌肝移植术后，如果选择AZD2014作为免疫抑制剂，或许可以降低肿瘤的复发率；此外，对于肝癌肝移植术后肿瘤复发的患者，改用AZD2014，或许可以同时兼顾抗排斥和抑制肿瘤进展的作用。

综上所述，我们在同种异基因大鼠肝移植排斥模型中证实了双mTORC1/2抑制剂AZD2014可以有效地抑制肝移植术后的急性排斥反应，该作用与诱导Treg细胞生成和抑制T淋巴细胞增殖有关。