miR-20a-5p 通过下调HOXB13 基因表达抑制肺癌细胞系A549增殖

肺癌为全球致死率排名第一的恶性肿瘤。近年来，肺癌的诊断、治疗技术取得了较大进展，但肺癌病人5年的存活期仍低于18%。研究肺癌的发生发展机制将为肺癌的诊断及治疗提供新的线索。同源盒蛋白B13（HOXB13）是一类前列腺谱系特异性转录因子。截至目前，关于HOXB13的研究均在前列腺癌中，在其他癌症中的研究还较少。据报道，肺癌中HOXB13异常高表达，促进了肺癌的转移，而HOXB13对肺癌细胞增殖的影响还未见报道，还需深入研究肺癌中HOXB13对细胞增殖的影响及其上游调控机制。

依据工程和水文地质条件，拟建场区地处淮河右岸，江淮丘陵北缘，属丘陵地貌，总体地形南高北低。场区主要位于采煤塌陷区内的垃圾填埋堆及其周边，受人工活动影响，地势高低不平，其中场地内的垃圾堆长度约600 m，宽50～150 m，呈不规则长条形，垃圾堆高度10～20 m，顶高40～48 m，垃圾堆四周地势较为平坦，多为麦田，总体地势略由西南向东北倾斜，地面高程34～38m。

miRNAs是一段长度为18～25 bp的非编码RNA，其参与调控了肿瘤细胞的多种进程（生长、增殖、凋亡和迁移）。而在肺癌中，miRNA调控HOXB13的研究还未见报道，因此本研究通过3种生物信息学软件预测了可能结合HOXB13的miRNA，分析发现miR-20a-5p是其最可能结合的miRNA。有研究表明，miR-20a-5p在肺癌中抑制了血管的生成，并抑制了肺癌的进程。而关于miR-20a-5p对肺癌细胞增殖的影响还未见报道。基于上述研究背景，我们推测miR-20a-5p可能通过调控HOXB13表达进而抑制了肺癌细胞的增殖。本文研究了HOXB13对肺癌细胞增殖的影响，并在体外探讨了miR-20a-5p对HOXB13的调控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人肺癌细胞株A549、H1299（中国科学院上海细胞库）。

称取1 g纳豆，放入离心管中，加入10 mL蒸馏水，放入离心机4000 r/min离心10 min取上清液，即粗酶液，将上清液倒入10 mL刻度试管中，即为样品溶液。

使用SPSS V22.0软件进行数据处理及统计分析。定量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，＜0.05为差异具有统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人肺癌细胞株A549、H1299 用于含10%胎牛血清DMEM完全培养基进行培养，培养环境为37 ℃、5%的CO，待细胞培养至对数生长期后进行后续实验。

1.2.3 HOXB13 过表达与干扰 HOXB13 siRNA 及HOXB13过表达质粒（上海吉玛生物科技有限公司）。将细胞铺到6孔板内，待细胞长到60%左右，按照转染试剂（Lipo3000）的 说明书将HOXB13 siRNA 及HOXB13过表达质粒转染到细胞。

1.2.2 miR-20a-5p转染 miR-20a-5p过表达及干扰（广州锐博生物有限公司）。将细胞铺到6孔板内，待细胞长到60%左右，按照转染试剂（Lipo3000）的说明书将等量的miR-20a-5p过表达及干扰转染到细胞。

1.2.4 Western blotting 检测HOXB13 蛋白表达情况细胞转染24 h后，收集细胞，离心后弃上清。加入RIPA，冰上放置30 min。低温离心（12 000，10 min），吸取上清。加入5×的蛋白上样缓冲液，100 ℃，5 min。SDSPAGE电泳（10%）后，进行转膜（冰浴，300 mA 90 min），随后开始封闭（5%脱脂奶粉，室温放置1 h）。最后加入HOXB13 I抗（1∶2000稀释），4 ℃放置过夜。随后，将膜取出加入1×TBST清洗3遍（10 min/遍）。清洗结束后，加入II 抗（1∶2000稀释），室温放置1 h，再将膜取出加入1×TBST清洗3遍（10 min/遍）。将洗好的膜放到曝光板上，正面朝上，加入显影液，化学发光成像仪曝光。

60例患者，随机分为中药治疗组和西药治疗组。患者均有3次或3次以上流产史，年龄24～36岁，夫妻双方染色体检查正常，无感染性疾病，无先天性生殖系统畸形。两组患者在年龄构成、观察指标等方面比较，无显著性差异（P＞0.05），具有可比性。

1.2.6 qRT-PCR检测miR-20a-5p及HOXB13 转染细胞24 h后，加入胰酶消化并收集细胞，按照RNA提取试剂盒说明书上的方法提取总RNA。通过qRT-PCR法检测并定量HOXB13 mRNA含量（GAPDH作为内参基因）和miR-20a-5p（U6 作为内参基因）。HOXB13 和GAPDH引物序列（表1）。数据计算使用2法。

1.2.8 EdU实验 EdU试剂盒用于检测细胞增殖情况，检测转染后的各组细胞的增殖情况。具体步骤为：加入用培液稀释后的EdU溶液1 mL(培液：EdU溶液=1000∶1），37 ℃放置2 h；弃液体，PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛200 μL/孔，固定30 min；弃液体，加入甘氨酸溶液（2 mg/mL）150 μL/孔，常温放置5 min；PBS清洗3次，加入200 μL/孔含0.5%的TritonX-100渗透液，放置10 min；PBS清洗1次；加入200 μL/孔的Appollo染色液，常温避光放置30 min；再用渗透液清洗3 遍，10 min/遍；用DAPI进行细胞核染色30 min，PBS清洗2次；最后荧光显微镜（Olympus BX51）观察并拍照。

qRT-PCR及Western blotting实验结果显示，过表达HOXB13后HOXB13的表达量与对照组相比较明显提高（＜0.05），而转染HOXB13 siRNA 后其表达量与对照组相比较降低（＜0.05，图1A～C）。CCK-8试剂盒检测结果显示，HOXB13过表达组促进了肺癌A549细胞增殖（＜0.05）；而HOXB13干扰后，肺癌A549细胞增殖受到了抑制（＜0.05，图1D）。EdU实验结果显示，HOXB13 过表达组EdU 阳性细胞数明显高于对照组（＜0.05）；而HOXB13干扰后，肺癌A549细胞EdU阳性细胞数明显低于对照组（＜0.05，图1E、F）。

1.2.7 CCK-8检测细胞增殖情况 CCK-8试剂盒用于检测细胞增殖情况，检测转染后各组细胞4个时间点（0、24、48、60 h）的细胞活力。细胞相对增殖活性=（实验组-空白对照组）/(实验组-空白对照组)，其中0表示第1个时间点测定值，N表示后面几个时间点测定值。

1.3 统计学处理

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基（Gibco）、10%胎牛血清（Sigma）、Lipo3000（Invitrogen）、RNA提取试剂盒（飞捷生物）、CCK-8 细胞增殖检测试剂盒（凯基生物）、RIPA 蛋白裂解液（碧云天）、HOXB13 I抗（Abcam）、GAPDH I抗（Santa cruz）、山羊抗兔Ⅱ抗（Santa cruz）、山羊抗鼠Ⅱ抗（Santa cruz）。

2 结果

2.1 HOXB13促进了肺癌细胞的增殖

⑧谢开云：《空灵含蓄的时空意象——两首<钗头凤> 比较赏析》，刘建英《浅谈陆游与 <钗头凤> 的前因后果》。钗头凤钗头凤

2.2 预测并验证HOXB13调控的miRNA是miR-20a-5p

通过生物信息学分析预测出miR-20a-5p 是HOXB13 结合的miRNA。为进一步验证miR-20a-5p是否调控HOXB13基因的表达，我们在2种肺癌细胞中干预miR-20a-5p的表达，24h后通过qRT-PCR及Western blot检测。Western blot结果显示，过表达miR-20a-5p后，细胞内的HOXB13蛋白表达水平与对照组相比降低；而干扰miR-20a-5p 表达后，细胞内的HOXB13蛋白表达水平与对照组相比升高（＜0.05，图2B,C）。qRT-PCR结果显示，干预miR-20a-5p表达后，细胞内的miR-20a-5p发生了明显变化（＜0.05，图2E），且细胞内的HOXB13 mRNA水平变化没有发生变化（＞0.05，图2D）。

2.3 miR-20a-5p抑制了肺癌细胞的增殖

在肺癌细胞内，干预miR-20a-5p 表达后，通过CCK-8试剂盒检测肺癌细胞增殖能力，结果显示，miR-20a-5p 过表达抑制了肺癌细胞的增殖（＜0.05）。而miR-20a-5p表达降低后，其细胞增殖能力增加（＜0.05，图3A、B）。EdU实验结果显示，miR-20a-5p过表达组EdU阳性细胞数明显低于对照组（＜0.05）；而miR-20a-5p干扰后，肺癌A549细胞EdU阳性细胞数明显高于对照组（＜0.05，图3C、D）。

2.4 miR-20a-5p抑制HOXB13基因表达进而抑制肺癌细胞的增殖

为阐明miR-20a-5p是否通过调控HOXB13基因的表达影响肺癌细胞的增殖，我们在肺癌细胞中同时过表达miR-20a-5p及HOXB13，24 h后采用CCK-8法检测肺癌细胞增殖能力，结果显示：同时过表达miR-20a-5p和HOXB13组对肺癌细胞增殖能力的影响位于单独转染miR-20a-5p过表达组及单独转染HOXB13过表达组之间，miR-20a-5p的过表达恢复了HOXB13基因过表达对细胞增殖的影响（＜0.05，图4A）。EdU实验结果显示，同时过表达miR-20a-5p和HOXB13组的EdU阳性细胞比例介于单独转染miR-20a-5p过表达组及单独转染HOXB13过表达组之间（＜0.05，图4B、C）。

3 讨论

有研究报道HOXB13促进胶质母细胞瘤的增殖、迁移及侵袭；子宫内膜癌中HOXB13高表达，并可以作为一个肿瘤诊断标志物；HOXB13 在胃癌中抑制了细胞的增殖、迁移及侵袭。已有研究表明HOXB13在肺癌中高表达，且促进了肺癌的转移。但关于HOXB13对肺癌细胞增殖的影响还未见报道。因此，本研究首先通过CCK-8细胞增殖实验，发现HOXB13促进了肺癌细胞的增殖，这一结果也验证了HOXB13可能在肺癌中促进了肺癌的进程。

1.2.5 生物信息学分析筛选HOXB13 可能结合的miRNA 为找出可能调控HOXB13基因表达的miRNAs，通过3种不同的生物信息学软件（TargetScan、miRanda及PicTar）筛选可能结合HOXB13的miRNAs。在候选miRNAs中，3种软件一致预测miR-20a-5p是HOXB13结合的miRNA。

miRNAs通过转录后调控机制调控靶基因的表达，在多种肿瘤中发挥不同的作用。miR-20a-5p在胃癌、鼻咽癌、三阴乳腺癌及头颈部鳞状细胞癌中高表达且促进了癌症的进程，而在子宫内膜癌、神经母细胞瘤及肝癌中低表达并可以作为一个抑癌miRNA发挥作用。截至目前，有关miR-20a-5p在肺癌中的研究还很少，尤其是miR-20a-5p对肺癌细胞增殖的研究还未见报道。本研究通过生物信息学预测并找到可能结合HOXB13 的miRNA 为miR-20a-5p，通过CCK-8细胞增殖实验及EdU实验发现，过表达miR-20a-5p可抑制肺癌A549细胞的增殖，而抑制miR-20a-5p会促进肺癌A549细胞增殖。结果表明miR-20a-5p抑制了肺癌细胞增殖，这一结果与HOXB13对肺癌细胞的增殖影响相反，与前人关于miR-20a-5p在肺癌中可能作为一个抑癌miRNA发挥作用的结果相一致。

综上，商家主动提供运费险对大部分消费者而言在购买产品时具有正向的引导作用，而对退货则并非具有较大的负面影响，退货费用的降低只是影响退货的众多因素之一，并非决定性因素。

为验证miR-20a-5p与HOXB13基因是否存在调控关系，本研究在肺癌的2个细胞系中干预miR-20a-5p的表达，通过Western blot实验检测细胞内的HOXB13蛋白表达水平。结果表明，过表达miR-20a-5p 后HOXB13蛋白的表达水平明显下降；而干扰miR-20a-5p后HOXB13蛋白表达水平明显升高；但HOXB13的mRNA水平却没有变化。以上结果表明，miR-20a-5p在肺癌细胞中在转录后水平调控HOXB13基因的表达。

记者今天(9月18日)从最高法获悉，最高法近日发布《关于在司法解释中全面贯彻社会主义核心价值观的工作规划(2018-2023)》，对未来5年的司法解释工作做出专门部署。记者注意到，《规划》提到，要适时出台防卫过当的认定标准、处罚原则和见义勇为相关纠纷的法律适用标准，鼓励正当防卫。

为进一步的验证在肺癌A549细胞中miR-20a-5p调控HOXB1基因表达，我们在肺癌A549细胞中共转染miR-20a-5p过表达和HOXB13过表达质粒，CCK-8及EdU实验结果表明共转染组的细胞增殖速率介于单独过表达miR-20a-5p组与单独过表达HOXB13组之间，说明细胞内miR-20a-5p过表达后逆转了HOXB13对肺癌A549细胞增殖的影响，说明miR-20a-5p通过调控HOXB13基因的表达抑制肺癌A549细胞的增殖。

综上所述，本研究发现HOXB13 可以促进肺癌A549细胞的增殖，且证明了miR-20a-5p可以抑制肺癌A549细胞的增殖，并证实miR-20a-5p可以通过负调控HOXB13基因的表达进而抑制肺癌A549细胞的增殖。然而，miR-20a-5p 负调控HOXB13 基因表达具体是怎么影响肺癌细胞增殖，miR-20a-5p是否可以作为肺癌诊断的一个生物标志物，miR-20a-5p与肺癌中小细胞肺癌、鳞癌是否有关？这些问题还有待后续进一步研究。