RUNX3调控胃癌细胞对曲妥珠单抗耐药的机制：基于超效高液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱的代谢组学分析

人表皮生长因子受体2（HER2）是由原癌基因ErbB2编码的跨膜蛋白，通过受体二聚体或激酶区磷酸化激活PIK/AKT/mTOR等信号途径，参与调控肿瘤的发生、发展及耐药。HER2不仅是胃癌化疗的重要靶标，也是选择化疗方式的参考指标，同时也是监测化疗效果的预后分子。曲妥珠单抗是靶向HER2的人源单克隆抗体，作为HER2阳性胃癌化疗的靶向药物，其通过拮抗HER2信号转导及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用发挥抗肿瘤作用。尽管曲妥珠能够延长晚期胃癌患者的总生存期，然而伴随化疗出现的肿瘤获得性耐药已不可避免。因此，研究胃癌曲妥珠耐药机制、阐明逆转耐药策略对提高化疗有效性具有现实意义。

③建设单位要进一步加强对施工单位水土保持措施施工的管理，特别是在签订施工合同时就应该注明各水土保持措施的工程量等；施工单位则应该合理安排各工序的施工顺序，注意施工顺序的合理性。

Runt相关转录因子3（RUNX3）属于Runt结构域家族成员，在肿瘤增殖、分化及肿瘤微环境中具有重要生物学功能。近年来，有关RUNX3突变与肿瘤耐药的研究备受关注，然而RUNX3与胃癌曲妥珠耐药的关系尚未阐明。我们的前期研究显示，曲妥珠耐药胃癌细胞RUNX3与DNA 的结合活性显著增加，敲除RUNX3可逆转其耐药，然而代谢水平RUNX3是通过何种途径调控胃癌细胞对曲妥珠耐药，尚不明确。因此，本实验以胃癌曲妥珠耐药细胞（NCI N87R）及RUNX3敲除细胞（NCI N87R/RUNX3）为研究对象，基于超高液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱的代谢组学研究NCI N87R/RUNX3细胞的代谢特征变化，结合生物信息学及功能验证阐释RUNX3在胃癌曲妥珠耐药细胞中的代谢调节作用。

1 材料和方法

1.1 主要仪器与试剂

1290型超高效液相色谱系统（Agilent），Q Exactive Focus四极杆/静电场轨道阱质谱仪和Heraeus Freco17型离心机（Thermo Fisher）；BSA124S-CW型电子天平（Sartorius）；JXFSPRP-24型研磨仪（上海净信）；Milli-Q 超纯水系统（Millipore）；PS-60AL超声仪（雷邦电子）；ACQUITY UPLC HSS T3（Waters）。甲醇、乙腈、乙酸铵、甲酸为HPLC级（CNW Technologies），L-2-氯苯丙氨酸（上海恒柏），曲妥珠抗体（罗氏制药），谷胱甘肽及辅酶Ⅱ检测试剂盒（碧云天），其它试剂均为分析纯。

1.2 样本制备及代谢物提取

人源胃癌细胞NCI N87由国家蛋白质科学中心惠赠，NCI N87R及NCI N87R/RUNX3为自建细胞系，细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM 培养液，NCI N87R和NCI N87R/RUNX3培养时加入80 μg/mL的曲妥珠。将细胞均分为2组，一组用于细胞计数，另一组用于实验。计数细胞用PBS洗2次，胰酶消化，充分混匀后计数。同法收集实验组细胞，PBS 洗2 次，加入1 mL PBS，用细胞刮刮取细胞，收集细胞悬液，按计数细胞对实验细胞数折算，确保各样本含有相同的细胞数且不少于1×10/mL。取等量细胞悬液，离心，细胞沉淀经液氮速冻后转移至-80 ℃保存。按文献方法提取代谢物，简单来说，细胞沉淀加入1 mL预冷甲醇-乙腈-水（2∶2∶1，）混合提取液（含内标L-2氯苯丙氨酸为1 μg/mL），震荡30 s；加钢珠2粒，45 Hz研磨2 min，冰水浴超声3 min，-20 ℃静置1 h，4 ℃、12 000离心10 min，上清经0.22 μm微孔滤膜过滤，质谱检测。取等体积待检样本（30 μL），充分混合作为质控（QC）样本。

1.3 色谱及质谱条件

采用SPSS21.0 软件进行数据统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本检验，＜0.05为差异具有统计学意义。

质谱条件：ESI离子源，正负离子电压分别为4.0 kV和-3.6 kV；毛细管温度400 ℃；扫描范围70～1000 m/z；鞘气流速45 Arb；辅助气流速15 Arb；全扫分辨率70 000；二级分辨率17 500；多级模式循环碰撞能为30±15 V。

目前，国内外对湖泊沉积物污染状况的评价尚缺乏统一的评价方法和标准，本研究采用综合污染指数法和有机污染指数法评价洞庭湖表层沉积物的污染状况，这两种方法常被用于湖泊沉积物污染评价研究。

1.4 数据预处理、统计分析及差异代谢物辨识

依据试剂盒检测NCI N87R与NCI N87R/RUNX3细胞GSH/GSSG水平。每组设定6个复孔，利用酶标仪检测412 nm 处吸光值，测定含量并计算GSH/GSSG。

正负离子所有QC 样本的变异偏差在±2 std（图1A、B），QC 样本呈正相关且相关系数r≥0.98（图1C、D）。PCA显示，正负离子所有QC处于95%置信区间，且代表各样本的点紧密聚集（图2A、D）。正负离子下QC内标的RSD分别为4.47%和3.68%。

数据导入MetaboAnalyst 5.0进行多变量分析，所有变量经均值中心化和pareto scaling标度化处理。用非监督的主成分分析（PCA）建立分类模型，观察样本组间聚类趋势及离群样本，采用有监督的偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）建立模型，并对模型进行7次循环交互验证及200次置换检验，R2表示模型稳定性，Q2表示模型预测能力，并依据PLS-DA模型中变量投影重要性（VIP）筛选对模型分组贡献较大的变量；进而使用独立样本检验和倍数变化（FC）筛选差异变量，选择VIP＞1、FC≥1.2或FC≤0.83且＜0.05的变量作为差异变量。使用OSI-SMMS（达硕信息技术）数据库进行差异代谢物辨识，根据分子质荷比、保留时间及二级质谱裂解信息对碎片离子匹配度打分，分值大于0.7的代谢物视为定性准确，依据HMDB数据库对外源性、药源性物质剔除。

将差异代谢物导入MetaboAnalyst 5.0数据库作通路分析，剔除＞0.05及通路影响值PIV＜0.1的通路，显示8条通路在NCI N87R/RUNX3细胞显著变化，其中谷氨酰胺代谢变化最显著（=2.1×10），其次为烟酸-烟酰胺及甘油磷脂代谢（=3.7×10，=9.0×10），谷胱甘肽、精氨酸-脯氨酸代谢显示较小的值（=0.001，=0.002）；而丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢具有最高的通路影响值（PIV=0.621），其次为谷氨酰胺（PIV=0.510）；烟酸-烟酰胺和谷胱甘肽代谢的PIV 分别为0.429 和0.368（图4，表2）。

广西与东盟国家的跨境人民币结算量增长趋势顺应双边进出口贸易持续上涨趋势，且在2016年进出口贸易增速下降的趋势下仍能保持总量增加的态势。但从增速看，2015年和2016年速度明显放缓，后劲不足。

1.5 通路富集分析与聚类分析

基于MetaboAnalyst 5.0数据库对差异代谢物进行通路富集分析，富集方法为Fisher's Exact Test；拓扑学方法为Relative-betweeness Centrality；富集数据库为KEGG。聚类算法为Pearson correlation 和Average linkage clustering。

1.6 还原型/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）测定

数据经ProteoWizard 转为mzML 格式，利用XCMS（参数设置如下：profmethos:binlin;method:centWave;ppm:60;peakwidth:8～30 scans;prefilter:9（3,100）；noise threshold:20；mzdiff:0.05 amu）进行保留时间校准、峰识别、峰匹配、峰积分，删除缺失值超过50%的变量，生成包括质荷比（m/z）、保留时间（RT）及峰面积的数据矩阵，采用最小值法填充缺失值，样本总面积法归一化。数据采集前连续检测QC样本3次，并在每组样本检测结束后插入QC 1次，检测过程每7个样本插入QC 1次，将QC数据中相对标准偏差（RSD）＞30%的变量剔除。

1.7 还原性/氧化性辅酶II（NADPH/NADP）测定

细胞计数后加入200 μL NADPH/NADP提取液，吹打促使细胞完全裂解，4 ℃、12 000离心10 min，收集上清，依据试剂盒检测450 nm处NADPH/NADP。

1.8 统计学方法

色谱条件：1290型超高液相色谱仪搭载HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），正离子模式：流动相A为0.1%甲酸-水；流动相B为乙腈；负离子模式：流动相A为5 mmol/L乙酸铵-水；流动相B为乙腈。洗脱条件：0～1 min，1%B；1～8 min，99%B；8～10 min，99%B；10～10.1 min，1%B；10.1～12.0 min，1%B；流速0.5 mL/min；柱温35 ℃，自动进样器温度4 ℃；进样量为5 μL。

2 结果

2.1 质控分析

根据工程投资估算和运行收益分析，1台1000 MW机组汽轮机回热系统优化投资费用总计1075万元，机组运行综合收益306.7万元/a，静态投资回收期约为3.5 a，具有较高的经济性。

2.2 代谢轮廓分析

公司一切进入正轨，许多事情都不用周桥亲力亲为，他只需最后拍板，按理说他应该开心才对，但事实恰好相反，他什么事情都要操心，员工们给的意见他也不爱听，总觉得属下不听他的话。

2.3 差异代谢物筛选及鉴定

根据火山图结合VIP值鉴定差异代谢物81个（图3A,B），其中正离子42个，负离子39个（表1）。采用热图显示差异代谢物的变化水平，其中43 个代谢物在NCI N87R/RUNX3中显著增加，38个代谢物显著降低（图3C）；代表性化合物的质谱鉴定（图3D，E）。

2.4 代谢通路富集分析

企业在国外的海外施工项目涉及的领域范围比较广，同时也要求管理人员具有扎实的物资管理方面的经验，还需要具备一定的语言沟通能力，了解到国际市场和国际贸易过程中的相关的政策以及相关的法规方面的基本常识。同时，也有效的应对海外项目施工现场管理过程中出突发情况，及时有效的处理相关的情况，可以推动项目施工工程的顺利发展，也是现代国外项目进行的一大趋势，施工现场的管理人员需要全面加强相关方面的学习，比如语言、市场营销、法律法规等方面知识的学习可以提高相关的管理人员的专业发水平。

2.5 敲除RUNX3导致NCI N87R细胞代谢失调

富集结果显示，NCI N87R/RUNX3细胞中谷氨酰胺通路代谢物，包括谷氨酰胺、谷氨酸、ADP、AMP、GMP、腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤核苷及鸟嘌呤的水平降低（＜0.001）；从代谢物水平看，谷氨酰胺、鸟嘌呤水平回调至亲本细胞相应代谢物水平；而ADP、AMP、次黄嘌呤和鸟嘌呤核苷低于亲本细胞相应代谢物水平（图5A）。NCI N87R/RUNX3细胞糖酵解代谢物磷酸二羟丙酮（DHAP）、三磷酸甘油酸（G3P）和磷酸烯醇丙酮酸（PEP）显著降低（＜0.001），且与亲本细胞相应代谢物水平相当（图5B）；嘧啶代谢物UMP、尿嘧啶及UDP显著增加（＜0.001），且向敏感细胞相应代谢物水平转归，而乳清酸盐与敏感细胞变化相反（图5C）；脯氨酸-精氨酸通路中SMA、脯氨酸、肌酸和瓜氨酸水平均升高（＜0.001，图5D）。

2.6 NCI N87R/RUNX3 细 胞GSH/GSSG 及NADPH/NADP降低

试剂盒检测结果显示，NCI N87R细胞GSH/GSSG及NADPH/NADP 比值较亲本细胞显著增加（图6A，B），而NCI N87R/RUNX3细胞GSH/GSSG比值较耐药组显著降低（＜0.05，图6A），NADPH/NADP的比值趋于降低（=0.07，图6B）。

结果显示，组间PCA分离明显，组内样本聚集良好（图2A、D）。PLS-DA模型显示，正离子模式44.4%的变量（R2X）可解释NCI N87R与NCI N87R/RUNX3组间99.7%的差异（R2Y），交叉有效性验证预测能力为95.1%［Q2（cum）］（图2B）；负离子模式45.1%的变量（R2X）可解释NCI N87R 与NCI N87R/RUNX3 组间99.8%的差异（R2Y），交叉有效性验证预测能力为95.8%［Q2（cum）］（图2E），两种模式下R2（Y）与Q2（cum）的差值小于0.3，Q2（cum）大于50%。置换检验显示，正负离子R2Y建模值与真实值（绿色图）组成的回归线截距分别为0.735和0.752；Q2建模值与真实值（蓝色图）组成的回归线截距分别为-0.526和-0.591（图2C、F）。

2.7 差异代谢物-调控基因网络分析

基于OmicsNet数据库构建差异代谢物-调控基因的关系，结果显示，整个网络由65个节点分子（Nodes）和127条边界线（Edges）构成，其中节点包括23种代谢物和42个调控基因，其中谷氨酸、AMP及ADP组成网络的中心（图7A）。在此基础上，构建谷氨酰胺代谢通路子网络，发现谷氨酰胺的3 个调控基因GLS、NADSYN1和GNPNAT1在NCI N87R/RUNX3细胞中的表达均降低（图7B）。而谷氨酸被13个基因所调控，其中表达上调基因3个（PLCB3、NFKB1和TSTD1），下调基因10 个（GLS、NADSYN1、GNPNAT1、GLA、CALB2、GCA、BIRC5、BCL2、GGH 和ASS1），其中GLS、NADSYN1和GNPNAT1为谷氨酸和谷氨酰胺共同调控基因。SRC 为AMP、ADP、GMP、鸟嘌呤核苷和鸟嘌呤的共调节基因。此外，还发现了鸟嘌呤核苷、鸟嘌呤、GMP、AMP 的调控基因，其中多数基因在NCI N87R/RUNX3细胞中表达下调（图7B）。甘油磷脂、烟酸-烟酰胺及丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酰胺代谢紊乱，这些通路均与能量代谢中心三羧酸（TCA）循环密切相关（图8）。

3 讨论

肿瘤耐药极具复杂性和异质性，而代谢失调是导致其耐药的重要特征和直接体现。因此，探究耐药细胞失调的代谢特征，不仅有助于深入了解肿瘤细胞增殖的原因，而且能够为逆转肿瘤耐药提供依据。本研究显示，敲除RUNX3可导致耐药细胞代谢途径改变，其中谷氨酰胺代谢及糖酵解途径抑制；而嘧啶、精氨酸-脯氨酸代谢激活；甘油磷脂、烟酸-烟酰胺及丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酰胺代谢紊乱，这些通路均与能量代谢中心三羧酸（TCA）循环密切相关。此外，与细胞氧化还原稳态相关的谷胱甘肽代谢抑制，包括GSH/GSSG 和NADPH/NADP比值降低，提示能量代谢紊乱及氧化还原稳态改变可能是RUNX3逆转NCI N87R细胞对曲妥珠单抗耐药的潜在机制。

谷氨酰胺代谢为肿瘤细胞糖酵解及氧化磷酸化提供了原料，也可通过调控糖、脂质、蛋白质代谢稳态诱导肿瘤耐药。谷氨酰胺经转运体转入细胞，并在谷氨酰胺酶（GLS）、谷氨酸脱氢酶（GDH）及天冬氨酸转氨酶催化下转化为α-酮戊二酸，后者不仅为其它代谢提供了中间产物，而且为TCA循环提供能量。另一方面，α-KG催化逆向生成乙酰辅酶A，可作为脂质合成原料，从而影响脂质代谢。作为线粒体催化酶，GLS在NCI N87R/RUNX3细胞的表达下降，且谷氨酸和谷氨酰胺水平降低，说明谷氨酰胺代谢受到抑制，这不仅对耐药细胞能量代谢产生影响，而且影响其它通路发生改变，提示抑制谷氨酰胺代谢是RUNX3逆转胃癌曲妥珠耐药的潜在机制。

谷子:① 草本植物,是我国北方的粮食作物;② 谷子的没有去壳的籽实,也叫粟,有的地区叫粟子。(注:②中的“谷子”应该改为“这种植物”)

作为维持机体氧化还原系统稳态的关键小分子活性肽，GSH通过调节代谢酶的活性维持GSH与GSSG的水平以达到胞内氧化还原平衡，然而，持续高水平的GSH导致肿瘤细胞DNA修复能力增强，进而促进其耐药。因此，降低GSH或者靶向GSH系统代谢酶可有效逆转肿瘤耐药。相比NCI N87R细胞，尽管GSH、GSSG在NCI N87R/RUNX3细胞中的水平增加，然而GSH/GSSG降低，提示GSH系统在NCI N87R/RUNX3细胞具有复杂的调节机制。GSH系统还可通过调节NADPH/NADP水平维系胞内氧化还原平衡，而GSH/GSSG及NADPH/NADP降低提示NCI N87R/RUNX3细胞氧化应激增加，还原势下降。

能量代谢重编程是肿瘤耐药的显著特征之一，尽管糖酵解产生的ATP净值不及氧化磷酸化多，然而肿瘤细胞仍以高速率的糖酵解为主要方式，以获得增殖所需的ATP，且糖酵解代谢中间体在代谢调控及抵抗氧化应激方面具有重要作用。虽然本实验构建的网络关系中没有发现调控糖酵解的相关基因，然而糖酵解关键分子DHAP、G3P及PEP在NCI N87R/RUNX3细胞显著降低，提示敲除RUNX3导致耐药细胞糖酵解抑制。

核苷酸代谢失衡不仅与肿瘤发生及转移有关，而且可通过影响代谢酶的表达促进肿瘤耐药。作为核苷酸代谢的重要组成部分，嘧啶代谢为肿瘤细胞DNA、RNA的合成提供了原料，其产生的β-丙胺酸及β-氨基异丁酸是肿瘤代谢所需的营养物质；精氨酸-脯氨酸代谢与肿瘤免疫及转移能力关系密切。相比耐药细胞，NCI N87R/RUNX3细胞嘧啶、精氨酸-脯氨酸通路分子的水平显著增加，推测这些代谢物可能对NCI N87R/RUNX3细胞起到能量代偿作用。此外，胞磷胆碱、磷酸二羟丙酮、胆碱、乙酰胆碱和磷酸甘油酸在NCI N87R/RUNX3细胞中显著增加，而溶血性磷脂酰胆碱水平降低，说明NCI N87R/RUNX3细胞甘油磷脂代谢发生了紊乱。综上所述，本研究表明，敲除RUNX3对胃癌曲妥珠耐药细胞代谢产生重要影响，而了解这些代谢特征有助于进一步认识RUNX3在胃癌曲妥珠耐药中的作用。