鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库的构建

殷玉瑾+张巫凡+张聪+王臣

摘 要：本试验旨在构建鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库。通过分子生物学方法，将鸡胚成纤维细胞cDNA片段连接于T7SeLect 10-1载体上，然后进行体外包装、原始文库的测定、扩增及滴度的测定、序列测定。实验结果显示，所构建的鸡胚成纤维细胞T7噬菌体原始文库的滴度为1.1×106pfu/mL，重组效率为60%，扩增后的鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库的滴度为1.8×1010 pfu/mL，鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库测序后经同源性比对，有9个噬菌斑的测序结果与鸡全基因同源，1个为空载体。本实验初步构建了鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库，为进一步研究鸡胚成纤维细胞蛋白相互作用提供了实验研究平台。

关键字：鸡胚成纤维细胞；T7噬菌体；噬菌体文库；蛋白质相互作用

鸡胚成纤维细胞（CEF）是一种常用的原代培养细胞， 在实验中常作宿主细胞，用于体外培养许多病毒。鸡胚成纤维细胞（CEF）存在病毒受体，因此能够增殖病毒。鸡胚成纤维细胞的原代培养在分子生物学，细胞学，遗传学，免疫学，病毒学，肿瘤学，及细胞工程学等领域，发展成为一门重要的生物技术，并取得顯著成就。T7噬菌体是裂解性噬菌体，在细胞质中完成组装后，成熟的噬菌体直接通过细胞裂解而释放。不像丝状噬菌体系统，展示在T7表面的多肽或蛋白质不需要通过细胞膜分泌出来，因而其表面展示多肽和蛋白的范围广。另外，T7噬菌体生长迅速、复制速度快、克隆效率高以及稳定的特性，使之成为替代其他传统系统的更好选择。为此，我们拟构建鸡胚成纤维细胞T7噬菌体表达文库，以期从中筛选出不同病毒的相关受体，为进一步研究鸡胚成纤维细胞蛋白相互作用提供了实验研究平台。

一、材料与方法

1.试验材料

T7Select10-1b? Cloning Kit （Novagen公司），鸡胚成纤维细胞cDNA：由本实验室制备和保存。

2.鸡胚成纤维细胞cDNA与T7受体臂的连接

在无菌的1.5mL管中混合cDNA片段与T7受体臂，然后轻轻地用移液器枪头上下吹打混匀，于16℃孵育12～16h。贮存于4℃，备用。

3.鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库的体外包装

向以解冻的25?L T7选择性包装提取物中加入5?L连接反应产物，室温孵育2h后，再加入270?L无菌LB液体培养基，终止反应。

4.鸡胚成纤维细胞T7噬菌体原始文库的测定

鸡胚成纤维细胞T7噬菌体原始文库进行测定，然后随机挑选10个阳性克隆，用 T7seleet UP/DOWN引物进行PCR检测其重组率。最后进行琼脂糖凝胶电泳。

5.鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库的扩增及滴度的测定

本实验选用平板法对文库进行扩增。首先将过夜培养的宿主菌按2%的接种量接种50 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600=0.6～1.0，贮存于4℃，备用。最后通过噬菌斑测定扩增后文库的滴度（同原始文库滴度测定）。

6.鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库的序列测定

取上述随机挑选的10个阳性克隆噬菌斑PCR产物，送至上海生物工程技术服务有限公司测序。测序结果NCBI进行比对，鉴定其与鸡基因全序列的同源性。

二、结果与分析

1.鸡胚成纤维细胞cDNA T7噬菌体原始文库的滴度

鸡胚成纤维细胞体噬菌体原始文库在倍比稀释度为10-3时的噬菌斑个数约100（图1），在稀释度为10-4时的噬菌斑个数为11（图2），代入公式：稀释倍数×10×板上噬菌斑的数量，计算得鸡胚成纤维细胞T7 噬菌体原始文库的滴度为1.1×106pfu/ mL。

2.鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库的重组子鉴定

随机挑选10个噬菌斑，用 T7seleetUP/DOWN引物进行PCR检测重组子比例，重组子为6个，占60%，即鸡胚成纤维细胞cDNA文库重组率为60%。

3.鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库扩增后的滴度

扩增后的鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库稀释度为10-7时的噬菌斑个数约为200，在稀释度为10-8时的噬菌斑个数为18，经计算得扩增后的鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库滴度为1.8 ×1010 pfu/mL。

三、讨论

鸡胚成纤维细胞是鸡胚成纤维细胞（ CEF） 是一种常用的原代培养细胞， 是许多病毒体外培养的宿主细胞， 是研究细胞相互作用的重要模型。噬菌体展示技术是近年建立和发展起来的利用噬菌体表达外源基因的一项新技术，它实现了基因型和表型的结合，提供了高效率的筛选系统。通过噬菌体展示技术的生物淘选过程， 筛选与靶标高度亲和的蛋白质序列， 从而有助于研究分子间的相互识别、相互作用的分子机制。本研究初步构建的CEF cDNA的T7 噬菌体表达文库，为今后利用文库筛选不同病毒在CEF上的细胞受体和研究其功能提供了材料来源，也为研究CEF 的基因及功能，以及病毒与CEF 的相互作用奠定了基础。

参考文献：

[1]刘永清，孙浩. 鸡胚成纤维细胞原代培养与纯化的初探[J].猪与禽，2008 ，2（1）：72-73.

[2]冀霞，赵瑞君，刘美德，等. 白纹伊蚁T7噬菌体展示cDNA文库的构建[J].寄生虫与医学昆虫学报，2012，19（2）：78-82.

作者简介：殷玉瑾（1995-），女，河南周口人，本科学历。

王臣（1979-），男，安徽六安人，博士学历，副教授，研究方向：动物分子病原学与研究学