外源性全氟丁基磺酸钾暴露对小鼠植入前胚胎发育的影响

宁安凤，肖南松，王瑚，管纯一，马旭*，夏红飞*

(1.国家卫生健康委科学技术研究所遗传优生中心，北京 100081；2.北京协和医学院研究生院，北京 100730)

全氟辛烷磺酰基化合物(perfluorooctane sulfonate，PFOS)作为全氟化合物(perfluorocarbons，PFCs)的典型代表，生产及使用时间已超过50 年，常在服饰、电子、机械等领域被用作防水防火等阻燃材料[1-2]。但由于其毒性持久并具有高度生物累积性导致人体已被检测出全氟化合物的存在，最高约达10-6mol/L[3-4]，并很有可能因此对人类健康造成威胁。因此，2009年PFOS就已被斯德哥尔摩公约成员国列入持久性有机污染物(persistent organic pollutants，POPs)名单中被禁用。

在欧盟高关注度物质(REACH)化学品注册系统评估方法等认定中，全氟丁基磺酸钾(PFBSK)虽亦具有含氟表面活性剂的一般性质，但由于氟碳链短(图1)和生物蓄积性不高等特点，被广泛应用于聚碳酸酯(PC)的阻燃剂。但近期发现，PFBSK具有高度持久可流动性并且可能具有生物毒性，在2020 年初被欧洲化学品管理局(ECHA)添加到REACH候选物质清单中。

图1 PFOS(左)与PFBSK(右)化学结构式

胚胎作为生物个体起始阶段其发育失常可能导致机体未来永久性的结构与功能异常，因此目前在胚胎早期就进行产前诊断。饶群等[5]研究发现，囊胚形态对非整倍体周期的植入前基因检测具有一定意义。有文献报道，PFOS急性毒性试验会引起斑马鱼胚胎发育形态异常、胚胎死亡率加剧及多种生理指标下调[6]。而PFBSK与PFOS具有一定相似性，尤其在高度持久性方面[7]，但PFBSK是否同样具有生物胚胎毒性尚未得知。

本实验选取具有代表性的哺乳动物小鼠作为研究对象，通过开展PFBSK急性毒性试验观察PFBSK是否对哺乳动物植入前胚胎发育造成一定影响。

资料与方法

一、研究对象

ICR品系健康小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，雄性10～12周龄小鼠8只，雌性6～8周龄小鼠80只。所有小鼠饲养在SPF级动物室，动物室温度约为25℃、相对湿度约为50%，噪声保持在60 dB以下。

二、研究方法

1.主要试剂：体外操作液、受精培养基、卵裂培养基、囊胚培养基、血清白蛋白(HSA)均购至美国Sage In-Vitro Fertilization公司；活性氧检测试剂盒(上海碧云天)；凋亡检测试剂盒(广州锐博生物)；注射用血促性素(PMSG)和注射用绒促性素(HCG)购至宁波三生生物；98% PFBSK(Sigma-Aldrich，美国)。

3.体外受精操作准备：实验前1天将受精培养基预平衡。在受精培养基中添加5%HSA，随后使用移液器在培养皿中制作约15个50 μl液滴，覆盖矿物油，于37℃、5%CO2、95%空气及100%湿度细胞培养箱中预平衡过夜。

6.受精卵卵裂与囊胚形成：将已培养5 h的受精卵换液至提前预平衡2 h以上含5% HSA的卵裂培养基中继续培养72 h，移入卵裂培养基前应先将受精培养基清洗干净；待72 h后，将卵裂培养基中的桑椹胚移入平衡2 h以上含5% HSA的囊胚培养基继续培养24 h至形成囊胚，移入前也将卵裂培养基洗净。

7.早期胚胎急性暴露PFBSK方式：精子与卵母细胞受精完成后，将约30颗受精卵设为一组，置于含有不同浓度[0 mol/L(对照组)、10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L及10-6mol/L]PFBSK的卵裂培养基中培养；72 h后移入各个相应PFBSK浓度的囊胚培养基中。在植入前胚胎体外培养过程中，统计对照组与各实验组的1-细胞数(受精卵，0 h)、2-细胞数(24 h)、≥4-细胞数(48 h)、桑椹胚数(72 h)及囊胚数(96 h)，并以1-细胞数为总数，计算其余时期胚胎的发育率。实验重复5次后，进行统计学差异性分析。

8.活性氧水平检测：利用活性氧检测试剂盒内的荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测。DCFH-DA进入细胞后会形成DCF发出荧光信号，继而用共聚焦显微镜检测DCF荧光信号强度(激发波长488 nm，绿色荧光)，并利用Image J计算平均荧光强度，以此代表活性氧水平。实验重复3次后，进行统计学差异性分析。

9.凋亡水平检测：凋亡检测试剂盒采用TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling(TUNEL)方法。经TDT酶催化作用，在DNA的3’-羟基末端催化参入florescein-dUTP发出荧光信号，使用共聚焦显微镜检测荧光信号强度(激发波长560 nm，红色荧光)，并利用Image J计算平均荧光强度，以此代表凋亡水平。实验重复3次后，进行统计学差异性分析。

三、统计学分析

利用GraphPad Prism9.0软件中t检验统计方法进行单因素方差分析。数据以百分率(%)或平均荧光强度(AU)进行表示，利用方差分析数据之间的组间差异。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、高剂量的PFBSK急性暴露对小鼠受精卵植入前胚胎发育的影响

本实验从受精卵培养于PFBSK处理过的培养基中开始统计，记为1-细胞数，并以此为总数，统计各个时期的发育率。结果显示，与对照组相比，PFBSK 10-4mol/L组、PFBSK 10-5mol/L组和PFBSK 10-6mol/L组的2-细胞率、≥4-细胞率、桑椹胚率及囊胚率均无显著性差异(P>0.05)，并且胚胎发育形态良好，未见异常；而PFBSK 10-3mol/L组的囊胚率与对照组相比显著下降(P<0.05)，且在囊胚时期观察形态发现，该组有部分胚胎停滞于桑椹胚，延长发育时期也无法使其生长至囊胚(表1，图2)。

表1 PFBSK药物处理组和对照组植入前胚胎发育率的比较[n(%)]

图2 PFBSK药物处理组和对照组植入前胚胎发育形态观察(×100)

二、高剂量PFBSK急性暴露对小鼠植入前胚胎活性氧水平的影响

胚胎发育率结果提示，当PFBSK达10-3mol/L时会对胚胎造成损伤。为研究损伤机制，选取PFBSK 10-3mol/L组与对照组发育96 h至囊胚时期的胚胎，进行活性氧水平比较。结果显示，PFBSK 10-3mol/L组平均荧光强度显著高于对照组(P<0.05)(图3)。此结果说明过量的活性氧可能是由于高剂量PFBSK急性暴露引起的氧化还原失衡所导致，而最终造成了囊胚异常发育。

A：共聚焦显微镜荧光图(×400)；B：平均荧光强度统计图。组间比较，*P<0.05。图3 10-3 mol/L PFBSK组和对照组活性氧水平的比较

三、高剂量PFBSK急性暴露对小鼠植入前胚胎凋亡水平的影响

为研究是否由活性氧堆积触发凋亡通路引起早期胚胎损伤，我们进行了TUNEL实验。结果显示，培养96 h后，PFBSK 10-3mol/L组囊胚时期胚胎虽出现了发育率下降现象，但与对照组相比，PFBSK 10-3mol/L组的胚胎细胞凋亡平均荧光强度无显著性差异(P>0.05)(图4)。

A：共聚焦显微镜荧光图(×400)；B：平均荧光强度统计图。图4 10-3 mol/L PFBSK组和对照组凋亡水平的比较

讨 论

随着新兴技术的蓬勃发展，大量的化学物质被广泛应用到各个领域，极大满足了人们日常需求，但由于长期接触类化合物后发现此类物质可能对人体产生不可逆损伤，因此外源性化学物质毒性研究日益受到重视。此外，在一些研究调查中，研究者凭借胚胎对环境敏感性，常利用胚胎检测环境中是否存在有害物质，以此对自然与社会环境进行优化[8]。因此，无论从何种角度来说，研究外源化学物质对胚胎造成损伤是十分必要的。

在工业使用及加工制品当中，PFBSK作为添加剂应用于各个领域，如电镀、纺织、皮革、造纸、消防、选矿等行业。根据用途不同，PFBSK释放量也有所不同，其中纺织、皮革、消防所占比重最大。国内有学者在2006至2008 年间，选取10座发展迅速城市检测了自来水中PFBSK含量，其中最高为18 ng/L[9]。而结合其他调查[10-13]，通过估算全国范围内水体PFBSK含量约为49.6 ng/L。尽管根据经济合作与发展组织(OECD)采用的检测方法观察到PFBSK 的生态毒性危害和风险均低于 PFOS，但目前并没有研究证明PFBSK不会导致人体急慢性中毒。胚胎毒性在PFCs家族中存在较为普遍，据文献报道除PFOS外，全氟辛酸(Perfluorooctanoic Acid，PFOA)也具有明显的胚胎毒性，小鼠妊娠期急性暴露PFOA会降低产仔数并使生殖系统发育不良[14]。因此，不难让人怀疑PFBSK作为替代品是否同样具有胚胎毒性。

本实验研究对象选择受精卵时期胚胎，通过高剂量急性暴露PFBSK建立损伤模型，统计植入前各个时期胚胎发育率与对照组差异以及胚胎细胞内活性氧和凋亡水平进行检测，来判断PFBSK是否具有胚胎毒性及以何种途径体现。实验结果发现，剂量在10-4mol/L、10-5mol/L和10-6mol/L PFBSK的外源性急性暴露并未引起植入前胚胎发育率下降，但在10-3mol/L PFBSK急性暴露下会影响胚胎细胞的囊胚率(P<0.05)，说明PFBSK存在着潜在的胚胎毒性；之后我们应用DCHF-DA探针进行胚胎细胞内活性氧的检测，发现10-3mol/L的PFBSK急性暴露96 h后，活性氧的水平显著高于对照组；既然外源性急性暴露PFBSK会引起新陈代谢异常产生大量活性氧，那么该行为可能会使早期胚胎诱发线粒体损伤。线粒体损伤严重可能引起细胞自主凋亡，为检测损伤是否直接引起早期胚胎走向凋亡途径，我们又应用florescein-dUTP探针进行检测凋亡水平。但在凋亡水平检测中并没有发现对照组与10-3mol/L PFBSK之间存在显著性差异。在毒性领域实验中，有PFCs成员暴露引起活性氧积累的氧化应激损伤案例[15]。活性氧作为第二信使的一种，因在植入前胚胎发育时期参与胞质成熟细胞信号转导，所以如若发生活性氧动态平衡失调极易诱发线粒体功能障碍引起胚胎损伤，例如出现植入前胚胎发育阻滞及死亡现象[16]。但由PFBSK急性暴露引起的堆积活性氧并未引起胚胎发育阻滞，现象仅为囊胚率异常，并且细胞凋亡水平也并未发现异常，所以PFBSK急性暴露可能并未引起自主有序死亡途径激活。活性氧异常升高可能导致多种途径发生改变，例如，高活性氧可能通过妨碍发育时期磷酸化作用和去磷酸化作用错误调节细胞周期，或使去乙酰化酶不能正常运转从而导致对植入前胚胎发育造成一定的负面影响[17-18]。

本文根据统计植入前胚胎发育率和检测生理指标，发现高剂量PFBSK急性暴露可能通过氧化应激损伤导致早期发育胚胎产生潜在的毒性，但对于揭示PFBSK对哺乳动物植入前胚胎发育影响的目标而言，尚需进一步的深入探讨。在进一步开展实验中应利用更为充分的检测方法评价微细结构和功能变化来验证PFBSK的胚胎毒性，并探究通过何种机制导致早期胚胎发育受阻，从而为PFBSK的调查与评估提供理论支持并向安全使用新型材料提供科学依据。