五氯硝基苯影响大鼠卵泡发育的机制研究

淡清华，骆海燕，张雨彤，高小博，陆彩玲*

(1.国家卫生健康委科学技术研究所遗传优生中心，北京 100081；2.北京协和医学院研究生院，北京 100005)

卵泡是卵巢的基本结构与功能单位，每个卵泡由一个卵母细胞及周围包裹的颗粒细胞和外层的卵泡膜包裹而成。根据Pedersen等[1]对卵泡的描述，卵泡发育分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡四个阶段。原始卵泡一般处于休眠中，只有少数原始卵泡被激活发展到窦卵泡阶段进一步排卵，大部分卵泡会发生闭锁[2]。卵泡生长期包括颗粒细胞增殖、分化和卵母细胞生长等过程，卵泡的成熟主要是在促性腺激素诱导下通过颗粒细胞介导调控[3]。多条信号通路参与卵泡发育的调控，包括磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)信号通路和MAPK信号通路等[4]。PI3K-AKT信号通路主要在原始卵泡向初级卵泡发育阶段发挥作用，加速原始卵泡的募集[5]。PI3K是细胞内重要的信号转导分子，它将下游的AKT招募到细胞膜上，通过传导信号促进卵泡的存活、生长和卵母细胞活化[6-7]。张力蛋白同源物(PTEN)是具有磷酸酶活性的抑癌基因[8]，McLaughlin等[9]研究发现PTEN抑制剂导致PI3K-AKT通路过度激活，促进AKT磷酸化，加速原始卵泡发育。MAPK信号通路主要参与卵泡发育中颗粒细胞的分化，高浓度的cAMP激活细胞内蛋白激酶A(PKA)，PKA 继而转录激活目的基因，合成特异性蛋白，促进颗粒细胞增殖[10-11]。

环境内分泌干扰物(EDCs)是一类具有干扰内环境平衡及生殖发育过程的外源性物质，包括农药、工业化学物质等环境污染物[12]。五氯硝基苯(PCNB)是一种具有EDCs性质的有机氯农药，广泛应用于农业生产的拌种、杀菌及花草树木的病虫防害[13]。PCNB化学性质稳定，难降解，通过食物链的传播长期暴露于食物供应和饮水中，对动物的生殖系统有毒性作用[14]。Arora等[15]研究发现口服PCNB的孕鼠在其后代中表现出腭裂以及胎儿死亡率升高等。王新[16]报道PCNB对小鼠睾丸产生毒性和氧化损伤作用，精子畸形率增加，引发生殖健康风险。我们实验室前期报道PCNB能改变青春前期大鼠卵巢甾体激素的合成水平，加速原始卵泡的发育[17-18]。在此我们探索PCNB影响青春前期大鼠卵泡发育的分子机制。

材料与方法

一、实验材料

1.实验动物：SPF级青春前期雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，21日龄，体重55～60 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，于国家卫生健康委科学技术研究所实验动物中心饲养，许可证号：SCXK(京)2016-0006。动物室温度22～24℃，空气相对湿度50%～70%，12 h昼/夜循环照明，保证大鼠充足的食水。所有实验均通过国家卫生健康委科学技术研究所动物伦理委员会批准(伦理批号2016-017)。

2.主要试剂和设备：五氯硝基苯(Sigma，美国)；玉米油(阿拉丁，中国)；BCA蛋白定量试剂盒(Thermo，美国)；P-AKT兔抗鼠单克隆抗体(Cell Signaling Technology，美国)；AKT兔抗鼠单克隆抗体(Cell Signaling Technology，美国)；PTEN兔抗鼠单克隆抗体(Cell Signaling Technology，美国)；β-actin小鼠抗人单克隆抗体(Thermo，美国)；山羊抗兔/小鼠IRDye-800CW二抗(LI-COR，美国)；超声波细胞粉碎机(Branson SLP，美国)；全自动酶标仪(Bioteck，美国)；红外激光扫描成像系统(LI-COR，美国)；Real-Time PCR System PCR仪(ABI，美国)；倒置生物显微镜(Nikon，日本)；低温高速离心机(Biotool，瑞士)；Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies，美国)。

二、研究方法

1.动物分组及染毒：将14只21日龄雌性SD大鼠随机分为对照组和实验组，每组7只。实验组采用PCNB(100 mg·kg-1·d-1)灌胃给药，对照组给予等体积玉米油。每日1次，连续7 d。

2.动物一般情况观察：包括精神状态、进食、活动情况。每天测量大鼠体重，根据体重调整用药剂量。最后一次染毒24 h后，用戊巴比妥钠麻醉后取血保存于普通真空采血管中，待大鼠安乐死后，分离双侧卵巢，去掉筋膜与脂肪组织，电子天平称卵巢重，得出卵巢系数 [卵巢系数(%)=卵巢湿重(mg)/体重(g)×100%]。一侧卵巢置于10%甲醛溶液中固定，另一侧卵巢置于液氮罐备用。

3.苏木素-伊红(HE)染色观察各级卵泡：卵巢在10%甲醛溶液中充分固定72 h后进行脱水，卵巢组织切片，常规HE染色，光学显微镜下观察。以每个卵巢切面上不同发育阶段卵泡数各占整个卵巢切面上总卵泡数的百分比表示各级卵泡的发育情况。卵泡分级参照文献分类方法[1]：原始卵泡由一个中央的卵母细胞和单层扁平的颗粒细胞组成；初级卵泡由中央的卵母细胞及周围单层的立方状颗粒细胞组成；次级卵泡的卵母细胞被2层或者2层以上的颗粒细胞包围，没有形成窦腔；窦卵泡中包含2层或者2层以上的颗粒细胞，有窦腔形成。生长卵泡总数是初级卵泡数、次级卵泡数和窦卵泡数之和。

4.卵巢组织样品RNA-Seq测序：对照组与实验组分别选取2个卵巢组织样本，进行 RNA 提取，利用Agilent 2100生物分析仪对组织样品RNA的完整性进行评估，RNA完整性系数≥7的样本用于后续分析。根据制造商的说明书，使用TruSeq链式mRNA构建文库。然后在Illumina测序平台上对文库进行测序。

利用 DESeq软件[19]对不同样本基因的counts数目进行标准化处理(采用BaseMean值来估算表达量)，计算差异倍数，并采用负二项分布检验的方式(NB)对reads数进行差异显著性检验，最终根据差异倍数(Fold change值)及差异显著性检验结果q值(Pvalue值)来筛选差异蛋白编码基因。筛选对应差异表达基因(|log2 Fold change|>2，q<0.05)的GO 条目和pathway条目，并用超几何分布检验的方法分析GO和KEGG富集分析，以校正后的q<0.05为阈值，满足此条件的GO词条和KEGG通路被认为具有显著性。

5.卵巢组织蛋白质提取定量及Western blot检测：切取部分大鼠卵巢组织，加入组织裂解液及蛋白酶抑制剂，超声粉碎后冰上继续裂解30 min。4℃、13 000 r/min离心15 min，收集上清，利用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。蛋白变性后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳分离蛋白，然后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)稀释的5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别用一抗(P-AKT；AKT；PTEN；β-actin)4℃孵育过夜；PBST洗膜后加入二抗室温孵育1 h；最后用红外激光扫描成像系统显示目的条带，ImageJ软件分析蛋白灰度值。

三、统计学分析

结 果

一、PCNB对大鼠生长及卵泡发育的影响

青春前期雌性SD大鼠连续灌胃7 d，对照组和实验组大鼠毛发、体形及精神状态均无明显异常。体重测量结果显示，与对照组相比，实验组大鼠体重增长无显著性差异(P>0.05)(图1 A)。与对照组相比，实验组卵巢系数轻微增加，但无显著性差异(P>0.05)(图1 B)。HE染色与卵泡计数结果显示，与对照组相比，实验组大鼠的原始卵泡数量显著减少(P<0.05)，生长卵泡的数量显著增加(P<0.01)，而卵泡总数没有明显变化(P>0.05)(图1C、D、E和F)。这些结果表明PCNB加速了青春前期SD大鼠原始卵泡的发育，与我们前期报道[18]相符。

A：大鼠体重；B：卵巢系数；C：HE染色(标尺=1 000 μm)；D：总卵泡数；E：原始卵泡占总卵泡数的百分比；F：生长卵泡占总卵泡数的百分比。与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图1 PCNB处理后大鼠体重、卵巢系数及卵泡数目的变化情况

二、PCNB对大鼠卵巢组织基因表达情况的影响

为了探究PCNB影响大鼠卵巢卵泡发育的分子机制，我们将对照组和实验组的大鼠卵巢组织进行RNA-Seq分析，根据蛋白编码基因的表达量进行差异筛选，检测到差异基因数量共有261个(|log2 Fold change| >1，q<0.05)。与对照组相比，实验组共有62个基因表达显著上调，199个基因表达显著下调(图2A)。差异分布火山图和差异基因聚类分析结果显示，PCNB暴露引起大鼠卵巢组织内基因表达发生显著改变，其中差异表达幅度排在前10位的上调基因包括Kcne2、Lect1和Rho等，下调基因包括Aqp4、Elf3和Pigr等(图2B和2C)。

A：差异表达基因统计柱状图；B：差异基因表达火山图；C：差异基因分组聚类图(标注出差异表达幅度排在前10位的上调基因和下调基因)。|log2 Fold change| >1，q<0.05。图2 PCNB处理后大鼠卵巢组织差异基因分布情况

三、大鼠卵巢组织差异表达基因的 GO分析和KEGG富集分析

GO分析结果显示，差异表达基因主要富集在细胞分化、蛋白磷酸化、细胞内信号转导及ATP结合的微管装配等(图3A)。KEGG 富集条目结果显示，差异表达基因主要富集在PI3K-AKT信号通路、cAMP信号通路及MAPK信号通路上，其中富集到PI3K-AKT信号通路的差异基因数量较多(图3B)。综合KEGG结果分析，提示PCNB对大鼠卵巢PI3K-AKT信号通路的影响更为明显。

A：GO富集分析展示图；B：KEGG富集分析气泡图。图3 PCNB处理大鼠卵巢组织内差异表达基因的生物学功能及分子信号通路的富集情况

四、PCNB对大鼠卵巢PI3K-AKT通路的影响

为了确定PCNB对PI3K-AKT通路的调控，我们检测了大鼠卵巢AKT的磷酸化水平及PTEN的表达。Western Blot结果显示，与对照组相比，实验组AKT磷酸化水平显著增加(P<0.05)，PTEN蛋白表达水平显著减少(P<0.05)(图4)，表明PCNB抑制PTEN的表达，激活PI3K-AKT信号通路。

A：Western Blot检测；B：蛋白相对表达水平柱状图(以对照组为1标准化)。与对照组比较，*P<0.05图4 PCNB处理后P-AKT及PTEN的蛋白表达情况

讨 论

我们前期报道PCNB改变青春前期大鼠卵巢内甾体激素孕酮合成，加速原始卵泡发育[18]。本研究我们主要对PCNB暴露影响大鼠卵泡发育的分子机制进行探究。

卵泡发育受多种生长因子和信号通路的复杂调控。为了探究PCNB影响大鼠卵巢卵泡发育异常的分子机制，我们将对照组和PCNB实验组的大鼠卵巢组织通过RNA-seq测序筛选的差异表达基因进行GO分析，发现差异表达基因主要富集在细胞分化、蛋白磷酸化和细胞内信号转导等，特别是在微管装配上富集较多，可能与细胞内物质运输或细胞分裂过程中微管的组装有关。KEGG 富集分析结果显示，差异表达基因富集的分子信号通路主要包括PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路和cAMP信号通路等，其中PI3K-AKT信号通路富集的差异基因数目相对较多。PI3K-AKT信号通路是卵泡发育早期的关键通路，调节原始卵泡的活化和生长[20]。Hannon等[21]报道工业污染物邻苯二甲酸单乙基己基酯通过过度激活PI3K信号通路加速了体外培养小鼠整个卵巢内早期卵泡的发育。赵倩[22]发现双酚A主要通过过度激活PI3K-AKT信号通路发挥促进原始卵泡发育的作用。结合我们的测序和生物信息学分析结果，提示PCNB可能影响PI3K-AKT信号通路调控卵泡发育。

为了确定PCNB对PI3K-AKT通路的影响，Western blot结果显示实验组较对照组AKT的磷酸化蛋白水平显著增加(P<0.05)，PTEN蛋白表达水平显著减少(P<0.05)。PTEN是PI3K-AKT信号通路的负调控因子，Reddy等[23]发现敲除PTEN的小鼠原始卵泡加速生长，导致原始卵泡池的早期耗尽。Jagarlamudi等[24]通过特异性敲除初级卵泡和生长卵泡卵母细胞中的PTEN发现，PI3K通路下游信号AKT磷酸化水平增加，加速原始卵泡的募集。我们的研究结果表明PCNB抑制PTEN的表达，激活PI3K-AKT通路，提示PCNB可能通过激活PI3K-AKT通路加速了大鼠原始卵泡的发育。MAPK信号通路主要参与促性腺激素诱导下卵巢颗粒细胞的增殖调控，促进卵泡的成熟[10]。在我们前期报道中，PCNB激活大鼠原代颗粒细胞和卵巢组织有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK3/1)信号通路[18]。另外已有研究证明MAPK信号通路参与大鼠原始卵泡的活化与生长，Zhao等[25]用MAPK3/1信号抑制剂培养新生鼠卵巢，发现原始卵泡数量减少。这些数据提示除了PI3K-AKT信号通路，MAPK通路也参与了PCNB对大鼠卵泡发育的影响。

有机氯农药具有内分泌干扰活性，可长时间残留在土壤及食品中，残留的农药本身和代谢产物可能会危害生物体的健康[26-27]。有机氯农药PCNB进入体内可代谢为五氯苯酚、五氯苯胺和甲基五氯苯基硫醚等多种产物。其中五氯苯酚可干扰类固醇受体导致雌鱼激素紊乱和性腺退化等不良反应[28]。有研究发现五氯苯酚暴露加速雌性虹鳟鱼卵母细胞发育，减少了可排卵的细胞数量[29]。提示PCNB对大鼠卵巢发育和功能的干扰可能也与其代谢物五氯苯酚有关。

综上所述，PCNB处理激活PI3K-AKT信号通路，抑制PTEN的蛋白表达，加速了大鼠原始卵泡发育。我们的研究初步阐述了PCNB暴露影响青春前期大鼠卵泡发育的分子机制，为基于毒理机制的PCNB生殖健康风险评估提供了实验依据。