精子DNA损伤对胚胎卵裂模式及胚胎发育的影响

朱家红，高洋，付涛，邹佳益，魏彪，韩伟，2，黄国宁，2*

(1.重庆市妇幼保健院生殖医学中心，重庆 400013；2.人类胚胎工程重庆市重点实验室，重庆 400013)

精液质量是影响辅助生殖治疗结局(包括受精率、胚胎质量及临床结局)的重要因素，这种影响泛称为“父系效应”[1]。传统的精液分析包括精子浓度、体积、活力及形态学分析。DNA损伤的精子可正常存活且形态正常，并能使卵母细胞受精，因此常规的精液分析不能准确反应精子DNA的完整性及其对胚胎质量、临床结局产生的影响。随着男性不育症的病因及机制研究逐渐深入，精子DNA完整性作为一个关键参数，为不育症患者的病因诊断提供了新的依据。目前关于IVF/ICSI周期中精子DNA碎片对胚胎发育及临床结局影响的研究较多，但结论仍存在争议[2-3]，因此在临床实践中并未常规评估精子DNA完整性，其可能原因是精子DNA碎片检测方法多样，不同方法得到的精子DNA碎片指数(DFI)的正常参考值范围不一，且研究的人群临床条件不一。精子染色质结构分析(SCSA)是量化精子DNA碎片水平、检查精子DNA损伤的常用方法之一。

随着时差培养技术的应用，其不仅可对植入前胚胎进行持续观察且无需取出培养箱，并可连续提供胚胎发育各阶段的详细定量参数及观察胚胎的卵裂模式。胚胎的早期卵裂在胚胎发育中具有重要作用，异常卵裂会影响囊胚形成率、胚胎染色体倍性及种植潜力[4-5]。目前植入前胚胎卵裂模式是否会受到精子DNA损伤的影响仍然未知。本研究通过时差培养系统观察记录胚胎卵裂模式、胚胎发育情况，随访胚胎移植后的种植结局，分析精子DNA损伤对胚胎早期卵裂模式、胚胎发育及种植的影响。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析2020年1月至2021年6月于重庆市妇幼保健院生殖医学中心接受不孕不育症治疗的432对不孕不育夫妇的临床资料，共432个取卵周期(其中224个周期行新鲜卵裂期胚胎移植)。纳入标准：(1)女性年龄<35岁；(2)女方卵巢反应正常；(3)夫妻双方染色体检查正常；(4)男方进行DFI检测。排除标准：排除供精、冷冻精液、受卵、解冻卵子及植入前遗传学诊断(PGT)周期。

将纳入患者根据授精方式不同分为IVF组和ICSI组，每组又按照DFI不同分为DFI<15%和DFI≥15%亚组，即：ICSI DFI<15%组(83例)，ICSI DFI≥15%组(105例)；IVF DFI<15%组(153例)，IVF DFI≥15%组(91例)。

二、研究方法

1.精液常规分析及精子DFI检测：(1)精液常规分析：男方禁欲2～7 d后于本院男科取精室手淫取精，工作人员确认标本完整性、待液化后根据WHO人类精液实验室检验手册(第5版)进行精子质量分析。(2)精子DFI检测：采用精子染色质结构分析(SCSA)方法进行精子DFI检测。通过流式细胞仪，分析精子核DNA的完整性。

2.控制性促排卵和人工授精：根据女方卵巢反应情况采用个性化的控制性卵巢刺激方案，包括促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂方案或GnRH拮抗剂方案。当超声测量有至少3个卵泡直径≥18 mm时，给予HCG注射。HCG注射后36 h超声引导下经阴道取卵。取卵当日收集新鲜精液，密度梯度离心后制备精液样本，于卵母细胞取出2～4 h后行常规IVF或ICSI授精，IVF授精浓度约为1万条精子/50 μl微滴。

3.Time-lapse胚胎培养及卵裂模式观察：进行原核观察后，将正常受精的卵母细胞转入时差培养箱培养，通过Embryo Viewer软件对受精后第3天的胚胎进行形态学评分并记录胚胎是否为正常卵裂模式。正常卵裂模式定义为在第1次细胞质分裂时卵裂成两个大小相同的不同卵裂球，第2次卵裂时两个卵裂球分别卵裂成两个大小相同的卵裂球[6]。

根据患者的宫腔条件及胚胎情况制定个体化的移植、冷冻或囊胚培养方案，剩余胚胎将继续培养至受精后第5天或第6天。

4.主要观察指标及定义：分别统计ICSI或IVF周期中的正常受精率、囊胚形成率、正常卵裂模式胚胎率以及临床妊娠率和流产率。IVF周期中2PN受精率=D1出现2PN卵子数/IVF加精卵子总数×100%；ICSI周期中2PN受精率=D1出现2PN卵子数/ICSI注射卵子总数×100%；正常卵裂模式胚胎率=正常卵裂模式胚胎数/2PN卵裂胚胎数×100%；囊胚形成率=囊胚形成数/囊胚培养数×100%；临床流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%。

三、统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料比较符合正态分布的采用t检验，不符合正态分布的采用秩和检验；率的比较采用χ2检验；相关分析采用Spearman检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、各组男性患者精液参数比较

ICSI和IVF周期中DFI<15%和DFI≥15%亚组间平均DFI、精子总活力和浓度均有显著性差异(P<0.05)；各组间男方年龄和体质量指数(BMI)无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 各组男性患者一般资料及精液参数比较(-±s)

二、各组中女性患者基本资料比较

ICSI和IVF周期中，DFI<15%和DFI≥15%亚组间的女方年龄、BMI、促排卵次数、抗苗勒管激素(AMH)、FSH、LH水平及促排卵过程中Gn用量和天数均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表2 各组女性患者基本资料比较(-±s)

三、各组患者胚胎发育情况比较

在胚胎发育方面，ICSI和IVF周期中DFI<15%和DFI≥15%亚组间的获卵数、MⅡ卵数、2PN受精率、D3可用胚胎数、正常卵裂模式胚胎率及优质囊胚率均无显著性差异(P>0.05)，仅囊胚形成率在不同DFI亚组间有显著性差异(P<0.05)(表3)。

表3 各组患者胚胎发育情况比较[(-±s)，%]

四、各组的妊娠结局比较

对224个鲜胚移植周期的妊娠结局进行统计分析发现，ICSI和IVF周期中DFI<15%和DFI≥15%亚组间平均移植胚胎数、平均移植优质胚胎数及正常卵裂模式胚胎数均无显著性差异(P>0.05)，临床妊娠率、种植率和流产率亦无显著性差异(P>0.05)(表4)。

表4 各组妊娠结局比较[(-±s)，%]

五、相关性分析

采用Spearman相关性分析探讨精子DFI与正常卵裂模式胚胎率及囊胚形成率之间的相关性，结果显示DFI与正常卵裂模式胚胎率无显著相关性(P>0.05)，但与囊胚形成率呈显著负相关(r=-0.562，P=0.029)。

讨 论

精子DNA损伤的原因包括：高水平氧化应激及精浆中抗氧化剂应对不足；精子染色质结构组织不良，使精子更容易受到氧化应激介导的损伤；药物、热、辐射等[7]。由于精子本身不能修复DNA损伤，其损伤永久存在。临床工作中常通过分析精子的浓度、活力以及形态来反映精子的质量，有研究表明精子的活力和形态与精子DNA的完整性密切相关，精子DNA损伤会对男性的生育能力产生影响[8]。本研究结果与之前文献[9]报道的相似，认为DFI可从分子水平上反映男性的生育能力，高DFI与精子浓度和活力下降相关。

2014年Simon等[10]的研究表明精子DNA损伤会对植入前胚胎产生父系影响，精子DNA损伤增加将会从受精开始对胚胎产生不利影响，并持续到胚胎移植后，导致种植率和妊娠率均显著降低。父系效应对植入前胚胎的影响可在受精后第1个细胞周期检测到，如产生高比例的异常受精胚胎，且倾向于缓慢卵裂和异常卵裂[11]。Anbari等[12]研究报道在IVF周期中胚胎卵裂模式与精子DFI水平无显著相关性(P>0.05)。本研究结果亦提示，ICSI周期和IVF周期中DFI≥15%和DFI<15%的两组患者的正常卵裂模式胚胎率无显著性差异(P>0.05)，提示胚胎的卵裂模式不受精子DFI水平高低的影响，或者可能是因为卵母细胞修复了部分精子DNA损伤的结果。目前对于卵母细胞修复精子DNA损伤的机制还不清楚，精子中心体对于有丝分裂纺锤体的影响可能是影响卵裂的潜在原因[13]。

有文献报道高精子DFI与低囊胚形成率相关[14]，也与胚胎发育停滞相关[15]。本研究结果提示囊胚形成率降低与高水平的精子DNA损伤有关。虽然父系对胚胎发育的影响可能在受精后就存在，但随着合子基因组激活，父系对受损染色质的影响逐渐突出。但尽管DFI≥15%组的囊胚形成率下降，最终所得的优质囊胚率并无显著性差异(P>0.05)。人类和动物模型证据均表明，在胚胎发育过程中早期胚胎有能力通过激活母体驱动机制修复精子内的DNA损伤，然而这种能力有限，其可能存在一个阈值，超过这个阈值，将无法修复；且该修复能力与卵母细胞的质量有关[16]。

本研究中，我们优先选择卵裂模式正常且相对优质的胚胎移植，观察精子DFI水平对种植率和流产率的影响，结果提示无论是ICSI授精还是常规IVF授精，DFI<15%组与DFI≥15%组间的2PN受精率、临床妊娠率和流产率均无显著性差异(P>0.05)，与Green等[17]的报道一致。但也有文献报道精子DFI水平高低对胚胎质量和临床妊娠率无明显影响，与流产率则呈显著相关(P<0.05)，精子DFI越高，流产率越高[2]。这可能与卵母细胞或胚胎的修复能力不同，以及移植胚胎质量的不同有关，Green等[17]的研究中移植的均是染色体正常的胚胎，本研究中移植的胚胎则经过了卵裂模式的筛选。Zhao等[18]报道高精子DFI的患者IVF周期妊娠率显著下降，ICSI周期的妊娠率未受影响，认为ICSI授精可以避免精子受到氧化应激的影响，减少精子DNA损伤。但也有学者认为高精子DFI对IVF周期的正常受精率和胚胎质量没有明显影响，这可能与IVF授精方式更接近自然受精，按照优胜劣汰原则自动筛除了高DFI的精子有关[19]。2017年和2021年的两项荟萃分析结果显示随着精子DFI升高，IVF或ICSI周期的妊娠率呈下降趋势，但平衡研究条件后精子DFI水平的高低对IVF/ICSI妊娠结局的影响无明显差异[20-21]。尽管精子DFI水平高低与男性的精液质量相关，但由于检测方法、研究人群以及设定阈值的差异，其对辅助生殖治疗过程中胚胎质量和妊娠结局的影响尚无统一定论。且本研究纳入样本量较小，研究结论存在一定的局限性，后续需要设计良好的大样本量随机对照试验进一步加以探讨。

综上所述，本研究结果提示精子DFI高低与男性的精子浓度和活力相关；胚胎的早期卵裂模式可能不会受到精子DFI的影响，而囊胚形成率降低与高DFI显著相关。虽然目前精子DFI高低对辅助生殖妊娠结局的影响尚无定论，但合理进行DFI检测，可能有助于综合评估助孕治疗效果，为不孕不育夫妇提供适宜的治疗建议。