FTO基因DNA甲基化与乙肝疫苗免疫低/无应答水平的关系

李嘉铃 周小婷 董柏青，2 陈钦艳 胡莉萍 王超 苏永健 李海，2

1广西中医药大学公共卫生与管理学院流行病学教研室（南宁 530200）；2广西中医药大学广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室（南宁 530200）；3广西壮族自治区疾病预防控制中心广西病毒性肝炎防治研究重点实验室（南宁 530029）；4广西中医药大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室（南宁 530200）

持续的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染若不加以干预，将逐渐发展成肝纤维化或肝硬化，甚至最终导致肝癌。据世界卫生组织（WHO）估计［1］，接种乙肝疫苗（HepB）是预防HBV感染的最安全有效的措施。近三十年来，随着我国将儿童HepB 接种纳入了免疫规划，新生儿出生时接种HepB 的覆盖率较高，HBV 感染发生率呈现显著下降趋势，现阶段人群HBV 感染率为5%～6%，5 岁以下儿童控制在0.2%左右［2］。但仍有5%～10%人群（包括部分婴幼儿和成人）在接种HepB 后，抗⁃HBs 浓度<100 mUI/mL 甚至无 抗体产生，处于低/无应答状态，从而不能有效抵御HBV 的感染［3］。

影响HepB 免疫应答水平因素有很多，其中最主要的是个体遗传因素［4］。在表观遗传学研究中，DNA 甲基化对基因表达的调控起着重要作用［5］。基因位点与DNA 甲基化水平有关［6］。FTO基因属于m6A 去甲基化酶，参与m6A 调控。研究表明FTO 基因发生DNA 甲基化可引起肥胖、糖尿病、肝炎和肿瘤等一系列疾病［7-8］，其中大多与肝病有关。宿主去甲基化酶FTO 基因的DNA 甲基化水平是否会导致该酶的表达产生偏离或者错误，该酶的功能发生改变，从而影响m6A 修饰，导致免疫分子表达异常和HepB 免疫低/无应答的发生，目前尚未明确。本研究拟通过分析宿主去甲基化酶FTO 基因的DNA 甲基化水平与乙肝疫苗低/无应答水平之间的关联性，为预测个体乙肝疫苗的应答水平，研发新型HepB 疫苗提供科学的依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象研究对象来源于2014-2016年间至广西南宁市三所三级甲等医院就诊的8～9月龄263 例儿童。纳入标准：（1）儿童的父母双方均为广西籍汉族人。（2）已按免疫程序接种三针乙肝疫苗。（3）肝功能项目正常者。（4）HBV DNA阴性者。（5）乙肝血清标记物检测中，除抗⁃HBs之外，其余四项均为阴性。（6）既往无HBV 感染及其他肝炎病史。（7）未罹患先天或基础性疾病者。排除标准：缺少以上纳入标准的任意一条或多条。

1.2 方法

1.2.1 研究设计根据研究对象的抗⁃HBs 浓度水平进行分组：（1）抗⁃HBs浓度<10 mIU/mL为无应答组；（2）10 mIU/mL≤抗⁃HBs浓度<100 mIU/mL为低应答组；（3）100 mIU/mL≤抗⁃HBs浓度<1 000 mIU/mL 为正常应答组；（4）抗⁃HBs 浓度≥1 000 mIU/mL 为高应答组。本研究采用非匹配病例对照研究方法，将无/低应答水平（抗⁃HBs 浓度<100 mIU/mL）作为病例组，正常/高应答水平（抗⁃HBs浓度≥100 mIU/mL）作为对照组。

1.2.2 血样采集研究对象完成乙肝疫苗免疫接种程序后的第8 周，采集其外周静脉血10 mL，用于检测“乙肝两对半”、HBV⁃DNA 及提取DNA 进行DNA 甲基化检测。

1.2.3 乙肝血清标记物检测取5 mL 全血分离出血清，采用微粒子酶免疫分析法（MEIA）和全自动化学发光仪（Abbott，AX⁃SYM）定量检测“乙肝两对半”，套式PCR 法检测HBV⁃DNA 。严格按照试剂盒说明书进行实验的各项步骤和结果判断。

1.2.4 血样DNA提取及浓度测定取另外5 mL全血，采用Trizol 法提取DNA。取5 μL 扩增产物采用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶图像成像系统中观察基因组DNA 的完整性：电泳条带清晰可见，无明显降解和RNA 污染；采用超微量分光光度计检测基因DNA 质量：检测DNA 浓度≥20 ng/μL，总量≥1 μg，OD260/280=1.7～2.0，OD260/230≥1.8。

1.2.5 引物设计与单位点PCR 条件优化采用上海天昊科技公司的专利软件，针对目标区域设计和优化多重PCR 引物。

1.2.6 重亚硫酸盐转化测序技术（BS⁃Seq）采用EZ DNA 甲基化试剂盒对DNA 进行重亚硫酸盐处理，将基因组中未被甲基化修饰的DNA 胞嘧啶C转变为尿嘧啶U。以优化后的多重PCR 引物为模板对经过重亚硫酸盐转化后样本目标片段进行多重PCR 扩增。

1.2.7 样本添加特异性标签序列与上机测序通过11 个循环数PCR 扩增技术将带有Index 序列的引物引入文库末端并添加特异性标签序列。将所有样品Index PCR 扩增产物等量混合后割胶回收，获得Methyl Target 测序数据库。确定产物浓度后以2×150 bp 的双端测序模式通过Illumina Hiseq平台，进行高通量测序并获得数据。

1.3 统计学方法采用IBM SPSS 20.0 软件对数据进行统计学分析，年龄符合正态分布，两组间年龄的比较用t检验。FTO 基因甲基化水平经正态性检验发现不符合正态分布，用中位数（M）和四分位距（IQR）进行描述。采用Mann⁃WhitneyU检验，比较观察（低/无应答）组和对照（正常/高应答）组FTO 基因DNA 甲基化水平的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

1.4 伦理审查本研究已通过广西伦理委员会的伦理审查（IRB SQ/01.01/02），研究对象的父母已知晓相关研究内容、目的并签署知情同意书。

2 结果

2.1 研究对象基本情况本研究共纳入263 例8～9月龄的广西汉族儿童作为研究对象，其中男童、女童分别为228 名（228/263，86.7%）、35 名（35/263，13.3%）；乙肝疫苗无、低、正常、高应答者分别为8 例（8/263，3.0%）、96 例（96/263，36.5%）、68 例（68/263，25.9%）、91 例（91/263，34.6%）；病例组104 例（104/263，39.5%），对照组159 例（159/263，60.5%）。观察组和对照组的性别（χ2=-0.004，P=0.953）和年龄（t=-0.08，P=0.930）构成比之间的差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。见表1。

表1 研究对象基本情况及抗⁃HBs 免疫应答水平分布Tab.1 Basic information and anti⁃HBs immune response level distribution of subjects

2.2 病例组和对照组FTO 基因DNA 甲基化水平比较分析观察组和对照组FTO 基因28 个位点CpG 岛DNA 甲基化情况与HepB 免疫应答水平的关系，结果显示：FTO 基因各基因位点的DNA 甲基化水平都比较低。观察组和对照组的DNA 甲基化水平 在FTO_1 基因222 位点、FTO_2 基因72 位 点的差异具有统计学意义。观察组FTO_1 基因222位点的DNA 甲基化水平高于对照组（Z=-2.38，P=0.009）。观察组FTO_2 基因72 位点的DNA 甲基化水平高于对照组（Z=-1.71，P=0.044）。见表2。

表2 病例组和对照组FTO 基因DNA 甲基化水平比较Tab.2 Comparison of FTO gene DNA methylation levels between the case group and the control groupM（P25，P75）

2.3 病例组与对照组FTO_1基因222位点、FTO_2基因72 位点的DNA 甲基化水平差异情况检测研究对象外周静脉血FTO_1 基因的222 位点和FTO_2 基因的72 位点的DNA 甲基化水平，以CpG位点为单位，通过boxplop 散点图表示观察组和对照组DNA 甲基化水平情况。见图1-2。

图1 观察组与对照组FTO_1 基因222 位点的DNA 甲基化水平差异情况Fig.1 Differences in DNA methylation levels of FTO_1 gene locus 222 between the case group and the control group

3 讨论

DNA 甲基化可通过改变基因的结构［9］、干扰转录因子［10］、改变染色体的形态［11］等影响蛋白质的表达，从而影响着人体的生理、病理活动。在许多疾病中，比如肿瘤，抑癌基因的启动子区通常发生了大量的⁃CH3修饰，导致转录出现障碍。在HBV感染的肝癌患者中肿瘤启动子区发生⁃CH3修饰水平明显高于慢性肝炎的患者［12］。可见，宿主基因DNA 甲基化在肿瘤、慢性肝炎等疾病中发挥着重要的作用，但未见DNA 甲基化与乙肝疫苗低/无应答的相关报道。

图2 观察组与对照组FTO_2 基因72 位点的DNA 甲基化水平差异情况Fig.2 Differences of DNA methylation levels of FTO_2 gene locus 72 between the case group and the control group

m6A 发生甲基化，可以影响DNA 完成转录后调控基因的表达和mRNA 的构型变化、解读及运转。FTO 酶作为m6A 去甲基化酶，在m6A 调控中是不可缺少的。有研究显示［13］肝细胞癌患者m6A甲基化水平均高于健康者；FTO 基因低表达水平预示肝癌良好的预后，降低FTO 表达后肝细胞繁殖的增加［14］。FTO 基因的rs9939609A 变异患者中肝炎的患病率更高［15］。FTO 基因rs1421085 的C、rs8050136 的A、rs3751812 的T 和rs9939609 的A 变异均与脂肪性肝病（MAFLD）风险升高相关［16］。可见，FTO 基因的DNA 甲基化水平会影响肝癌、肝炎、脂肪性肝病等肝类疾病的发生发展，但宿主FTO 基因DNA 甲基化水平是否会影响RNA 的转录调控和蛋白表达，从而影响m6A 修饰，导致免疫分子表达异常和HepB 免疫低/无应答的发生，目前未见相关报道。基于以上观点，猜测去甲基化酶FTO 基因发生DNA 甲基化后，可能会导致该酶的表达产生偏离或者错误，酶的功能发生改变，影响m6A 修饰调控作用，从而影响机体免疫系统，导致乙肝疫苗低/无应答现象的发生。

为了验证这一猜测，本研究采用非匹配病例对照的研究方法，对263 例8～9月龄广西汉族儿童进行FTO 基因DNA 甲基化水平测定，分析其与乙肝疫苗免疫应答水平的关联性。结果显示：FTO基因各基因位点的DNA 甲基化水平都比较低；观察组和对照组的DNA 甲基化水平在FTO_1 基因222 位点、FTO_2 基因72 位点的差异具有统计学意义；观察组FTO_1 基因222 位点的DNA 甲基化水平高于对照组；观察组FTO_2 基因72 位点的DNA甲基化水平高于对照组。这提示人体中FTO 基因存在发生甲基化的可能，乙肝疫苗接种者免疫低/无应答水平可能受FTO_1 基因222 位点、FTO_2 基因72 位点的影响。由此，推测FTO 基因作为去甲基化酶，通过DNA 甲基化修饰后可能使酶的结构发生改变和相应的功能也随之发生改变，导致m6A RNA 甲基化修饰出现异常，影响RNA 的转移、稳定、翻译、降解等过程，从而影响蛋白质的合成，可能使宿主免疫调节分子的基因表达发生改变，引起HepB 接种者免疫低/无应答水平的发生。

本研究存在一定的局限性和不足之处。第一，研究样本量较小，研究对象局限于广西汉族儿童，研究地区局限于广西南宁市三所医院；第二，未收集儿童的出生体质量、身长、疾病状况、营养状况、分娩方式等其他可能的影响因素；第三，未能对FTO 基因发生DNA 甲基化的靶基因mRNA 表达进行验证。因此，本次研究可能会存在一定的选择偏倚和混杂偏倚。在今后研究中，应扩大样本量和研究对象范围，选取多家医院或社区开展研究，开展相关的动物体内、体外试验，通过敲除或过表达去甲基化酶FTO 基因，进一步深入探讨靶基因mRNA 表达和乙肝疫苗免疫应答水平的关系，从而预测个体乙肝疫苗免疫应答的水平，为研发新型疫苗提供依据。