基于一测多评法测定白芍中6 种成分含量∗

张生杰，王 丽，田志梅，曹雪芹，庞文娟

武威市药品检验检测中心，甘肃 武威 733000

白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactifloraPall.的干燥根，具有平肝止痛，养血调经，敛阴止汗功效［1］。白芍含有多种生物活性物质，主要有苷类、萜类、黄酮类、鞣质类、挥发油类、酚类和糖类等化合物，含白芍中成药处方600 个，涵盖主治疾病165 种、主治证候159 种［2］，白芍药材的市场需求量较大，导致目前多个地方开始引种芍药，关于所引种栽培白芍药材质量如何，与其主产地白芍药材质量是否一致尚未见研究报道，因此建立一种简单、快速的白芍多指标质量控制方法尤为重要。

一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）由王智民课题组首次提出［3］，通过建立样品中某一有效、廉价、易得的典型成分与样品其余成分间的相对校正因子以计算样品中其他成分的量。王智民等［4］建立的《一测多评质量评价技术指南》，被认为是适合中药特点的多指标质量控制与评价模式，目前已广泛应用于药品质量控制领域［5-8］，一测多评法是中国药典2015 版中重点推广的技术之一，也是未来中药多组分同步检测的发展方向之一［9］，同时“一测多评”也将为中药检测方法的“绿色化”提供更有效的技术手段和途径［10］。因此，本研究主要以甘肃河西地区引种白芍和主产区（安徽亳州、浙江磐安、四川中江、山东菏泽）白芍为研究对象，采用高效液相色谱法建立QAMS 分析方法，同时测定没食子酸、儿茶素、芍药苷内酯、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍药苷6 种成分的含量，以芍药苷为内参物，建立芍药苷与其他5 种成分的相对校正因子，同时考察多个因素的耐用性及系统适用性，并测定不同产地白芍饮片，其结果与外标法测定结果进行t检验，以验证所建QAMS方法的准确性和可行性。

1 材料

1.1 仪器LC-20AD 高效液相色谱配有DAD 检测器（日本岛津公司）；Agilent1260 与Agilent1100高效液相色谱（美国安捷伦公司）；MS105DU 十万分之一电子分析天平（梅特勒托利多）；UA10MFD超声波清洗器（德国wiggens）。

1.2 试药共收集25 批白芍样品，其中包括来自4 个主产地的20 批白芍样品，5 个甘肃河西地区引种的白芍样品。对照品没食子酸（批号：110831-201906，含量以91.5%计）、儿茶素（批号：110877-201604，含量以99.2%计）、芍药苷内酯（批号：190027-201902，含量以98.0%计）、芍药苷（批号：110736-201943，含量以95.1%计）购于中国食品药品检定研究院；1，2，3，4，6-五没食子酰基葡萄糖（批号：230031-201909，含量以98.0%计）、苯甲酰芍药苷（批号：02003-201902，含量以98.0%计）购于北京更新生物科技有限公司；乙腈（色谱纯，默克Merck 公司、批号：10945730812），其他试剂均为分析纯。

统计研究乳腺肿块患者中，良性肿块血流显示率66.7%（16/24），Vmax 为（11.40±6.35）cm/s，RI 为（0.55±0.11）；恶性肿块血流显示率为95.7%（44/46），Vmax 为（16.25±10.25）cm/s，RI 为（0.66±0.12），对比两组肿块血流显示率、Vmax、RI差异显著，有统计学意义（P＜0.05）。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液制备取对照品没食子酸、儿茶素、芍药苷内酯、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍药苷对照品适量，用甲醇配成含没食子酸105.31mg/L、儿茶素115.43mg/L、芍药苷内酯403.12 mg/L、芍药苷997.35 mg/L、1，2，3，4，6-五没食子酰基葡萄糖303.54 mg/L、苯甲酰芍药苷107.35 mg/L的混合对照品溶液。

为了能够让农场主自行存储农作物，让农产品的价格维持在一个较为稳定的状态，美国政府推出了储备补贴制度。该制度主要指农场主通过与农产品信贷公司签订储备合同，在农产品存储期间，不仅可以获得高于无追索权贷款率的贷款，而且能够获得一定的储备补贴。但是当农产品被储存之后，农场主不能私自随意进行出售，必须在市场价格达到设定的释放价格数值时才能够将其售出[6]。如果达到释放价格后农场主不愿意出售，那么政府将取消相应的利息补贴和储备补贴；如果作物价格已经达到制定的收回贷款价格时，此时相关农作物贷款人必须归还所贷款项。

2.6 真菌对抗菌药物的敏感性 培养出白色念珠菌292株，占分离细菌株的11.50%。对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶均敏感。

精密取混合对照品储备液，稀释5、10、15、20、25 倍分别进样10 μL，测定没食子酸、儿茶素、芍药苷内酯、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍药苷的峰面积，以芍药苷为内参物，分别计算没食子酸（A）、儿茶素（B）、芍药苷内酯（C）、1，2，3，4，6-五没食子酰基葡萄糖（D）、苯甲酰芍药苷（E）相对于芍药苷（S）的相对校正因子fA/S、fB/S、fC/S、fD/S、fE/S。各成分相对校正因子的相对误差（RSD）分别为0.33%、0.20%、0.32%、0.12%、0.12%，均小于0.5%，表明方法有效。见表2。

2.3 色谱条件色谱柱：Shim-pack GIST-HP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）。流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱：0～10.0 min，95%～90% B；10.0～20.0 min，90%～80% B；20.0～30.0 min，80%～70%B；30.0～35.0 min，70%B；35.0～37.0 min，70%～50%B；37.0～50.0 min，50%B。检测波长：232 nm，体积流量：1.0 mL/min，柱温：30℃，进样量：20 μL。

2.4.3 精密度试验 称取甘肃省金昌朱王堡引种栽培白芍样品约1.0g，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，以“2.3”项下色谱条件连续进样5次，测定峰面积。没食子酸、儿茶素、芍药苷内酯、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍药苷峰面积的RSD 分别为0.69%、0.29%、0.70%、0.16%、0.36%、0.81%，表明仪器精密度良好。

我国出口企业劳动力成本和税收高于周边一些发展中国家，人民币升值对我国出口企业的影响较大，导致小微出口企业的融资成本居高不下。应加快完善支持外贸发展的财税金融政策，降低出口企业的融资成本，为降低出口商品的成本助力，使中国制造在国际市场上更有价格竞争力。

2.6.5 不同pH 值对校正因子的影响 取混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件调整流动相磷酸水体积分数为0.01%、0.05%、0.10%，其他色谱条件不变，记录峰面积，按“2.5”项下方法计算相对校正因子，结果RSD值均小于2.0%，表明各成分相对校正因子在磷酸水体积分数0.01%～0.10%范围内耐受性良好。见表7。

图1 色谱图

2.4.2 线性关系考察 精密取混合对照品溶液，依次用甲醇溶液稀释20、10、5、2倍，并与对照品溶液组成一系列混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件分别进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程。见表1。

表1 6个化合物峰面积与浓度线性关系

2.4 HPLC方法学考察

就餐区域、购物区域以及商品展示区是目前商场的主要组成，个性化针对的是展示区设计进行的创新。该区域的构造、灯光色彩等可保留原来设计的精华，在此基础上进行相应优化，使展览的商品更加个性，增加其卖点。每个陈列架的设计要和商品相得益彰，最大程度地凸显商品特色。例如在服装展示区，男装和女装在展架设计上存在明显差异，前者需要设计高端、奢华的衣橱，并在灯光的烘托下，将服装精细的做工、优质的面料展现在消费者面前。后者设计时需要相对宽敞的空间，将款式不同的衣服陈列在相应区域，给消费者造成视觉冲击，使其感觉服装款式新颖多样。

2.4.5 重复性试验 称取甘肃省金昌朱王堡引种栽培白芍样品6 份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，测定各成分含量。结果没食子酸、儿茶素、芍药苷内酯、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍药苷含量平均值分别为0.83、0.82、4.65、28.66、4.26、0.88 mg/g，RSD 分别为1.47%、1.27%、1.02%、0.85%、0.74%、0.92%，表示该方法重复性较好。

2.6.1 不同仪器对相对校正因子的影响 取混合对照品溶液，用Shim-pack GIST-HP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）考察LC-20AT 型、Agilent1260型、Agilent1100型3种高效液相色谱系统，按“2.3”项下色谱条件，各进样5、10、15、20、25 μL，记录峰面积，按“2.5”项下方法计算相对校正因子，结果RSD值均小于2.0%，表明不同仪器型号对相对校正因子影响不明显。见表3。

2.5 相对校正因子的建立校正因子计算。在一定线性范围内，某一组分的量与检测器响应值成正比，在进行多指标评价时，以样品中某一代表组分为内标物，建立该组分与其他组分之间的校正因子（relative correction factor，RCF），通过相对校正因子计算其他组分的含量［4］：

式中fsi为内标物s 与组分i 之间的校正因子（f），AS为内参物S 峰面积，CS为内参物浓度，Ai为某待测成分i峰面积，Ci为某待测成分i浓度。

2.2 供试品溶液制备取白芍细粉1.0 g，精密称定，置150 mL 三角瓶中，加入70%乙醇约50 mL，称定重量，超声（300 W，50 kHz）处理30 min，放冷，再称定重量，70%乙醇补足，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.4.4 稳定性试验 称取甘肃省金昌朱王堡引种栽培白芍样品约1.0g，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于2、4、8、10、12、24 h按“2.3”项下色谱条件测定峰面积。结果供试品溶液在24 h 内色谱峰面积无明显变化，没食子酸、儿茶素、芍药苷内酯、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍药苷的RSD 分别为0.59%、0.26%、0.11%、0.25%、0.97%、0.27%，表明供试品溶液在制备后24 h内稳定性良好。

表2 相对校正因子

2.6 相对校正因子的耐用性

阅读和写作是“辩证互补的关系”，在平时的语文教学中，我们要充分利用好教材这个“例子”，把阅读教学和写作教学有机结合起来，相互促进，共同提高。在学习人教版语文教材必修1第二单元的古代记叙散文时，我们既要积累相关的文言基础知识、学习古代记叙散文的阅读方法，也要注意学习这些课文在写人记事等方面的写作技巧，通过渗透、整合等方式把写作教学和古文阅读教学有机地结合起来，相互促进，提高学生的阅读和写作水平。

2.4.6 加样回收率试验 取已知含量的白芍样品（杭州-1）9 份，每份约1.0 g，精密称定，分成3组分别精密加入混合对照品储备液3、5、7 mL，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项下色谱条件下进样，记录色谱峰峰面积，没食子酸、儿茶素、芍药苷内酯、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍药苷的平均加样回收率分别为99.0% 、99.4%、98.6%、99.4%、99.3%、99.0%，RSD分别为1.08%、0.80%、1.27%、1.24%、0.90%、0.76%。

表3 不同仪器测定的相对校正因子（n=3）

2.6.2 不同色谱柱对相对校正因子的影响 取混合对照品溶液，采用LC-20AT 型高效液相色谱系统，考察色谱柱CAPCELL PAK-C18MGⅡ（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）、Shim-pack GIST-HP C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）、Agilent XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）、Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）4 种不同品牌和型号色谱柱，按“2.3”项下色谱条件分别进样5、10、20 μL，记录峰面积，按“2.5”项下方法计算相对校正因子，结果RSD 值均小于2.0%，表明不同色谱柱对各相对校正因子无明显影响。见表4。

表4 不同色谱柱测定的相对校正因子（n=3）

2.6.3 不同柱温对相对校正因子的影响 取混合对照品溶液，采用LC-20AT型高效液相色谱系统和Shim-pack GIST-HP C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）色谱柱，考察色谱柱不同柱温25、30、35℃对相对校正因子的影响，结果RSD值均小于2.0%，表明相对校因子在柱温25～35℃的耐受性良好。见表5。

国内齿圈热处理主要应用高频感应淬火工艺，但是因感应器的结构会带来不同的淬硬效果。通常齿圈上下两端面的淬硬层深度相同，即两端面的淬硬层硬度也相同，硬度高了就会产生齿心部脆易断裂的缺陷，大大降低齿的耐用性。在齿圈的实际工作时，仅仅与啮合齿轮接近的端面受较大的冲击，而与飞轮连接贴合的端面应该保持较软具有缓冲的功用最佳。这样归结起来就是齿面硬、齿心部相对较软才是最佳的齿圈淬火状态，倒梯形结构的淬火感应器可以达到这个“外硬内软”的理想状态。

表5 不同柱温下测定的相对校正因子（n=3）

2.6.4 不同流速对相对校正因子的影响 取混合对照品溶液，采用LC-20AT 型高效液相色谱系统和Shim-pack GIST-HP C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）色谱柱，考察色谱柱不同流速0.8、1.0、1.2 mL/min 对相对校正因子的影响，结果RSD 值均小于2.0%，表明（1.0±0.2）mL/min 的流速波动对相对校正因子无显著影响。见表6。

表6 不同流速下测定的相对校正因子（n=3）

2.4.1 专属性考察 取没食子酸、儿茶素、芍药苷内酯、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰基葡萄糖及苯甲酰芍药苷对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件进行测定，分别采集6 种成分的光谱图，通过DAD 检测器采集3D 谱图，比对样品中各测定成分与相应对照品的光谱图，结果供试品中各待测成分光谱图相似度均＞0.99，色谱峰分离度均＞1.5，其他杂质峰对待测成分均无干扰。见图1。

表7 不同pH下测定的相对校正因子（n=3）

2.6.6 不同实验人员对校正因子的影响 取混合对照品溶液，3 位不同实验员按“2.3”项下色谱条件测定，记录峰面积，按“2.5”项下方法计算相对校正因子，结果RSD值均小于2.0%，表明不同实验人员对相对校正因子影响不大。见表8。

表8 不同实验员测定的相对校正因子（n=3）

2.6.7 相对校正因子的确定 将上述各实验获得的fsi值取平均值，最终确定没食子酸（A）、儿茶素（B）、芍药苷内酯（C）、1，2，3，4，6-五没食子酰基葡萄糖（D）、苯甲酰芍药苷（E）相对于芍药苷（S）的相对校正因子分别为fA/S=0.699、fB/S=0.548、fC/S=1.470、fD/S=0.709、fE/S=0.656，RSD 分 别 为0.38%、0.38%、0.28%、0.62%、0.16%。

2.7 待测成分色谱峰定位采用待测组分（a）与内标物（s）的相对保留时间比值（ra/s=ta/ts）或保留时间差（ΔtR-AS=ta-ts）进行定位［4］。分别考察相对保留时间比值和保留时间差2 种参数在不同品牌仪器、不同规格色谱柱中的重现性，结果采用相对保留时间进行峰的定位较保留时间差的定位更可靠。见表9。

表9 不同仪器不同色谱柱下测得的相对保留值和保留时间差

2.8 QAMS 法与外标法测定结果的比较取四大主产和甘肃栽培白芍样品25 批，按“2.2”项下制备样品溶液，按“2.3”项下色谱条件分别测定样品中没食子酸、儿茶素、芍药苷内酯、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍药苷峰面积，分别采用外标法（external standard method，ESM）和QAMS法计算各组分含量，结果见表10。

2014年，山东将坚持开源与节流并重、城乡保障与生态保护并行、兴利与除害统筹、公益化支撑与市场化运作结合、改革创新与夯实基础并举，增强水利发展的内在活力。

表10 ESM法和QAMS法测得的白芍6种成分含量（n=25） mg/g

3 讨论

3.1 提取方法的确定在前期试验方法研究和文献查阅的基础上［11-14］，本试验分别考察了不同浓度乙醇提取溶剂及超声、回流不同提取方法，发现采用70%乙醇50 mL，超声（300 W，50 kHz）处理30 min，能够兼顾上述6种成分，得到最优提取率，杂质干扰峰少，且方法简单快捷。

3.2 待测化合物的确定色谱峰的准确定位是QASM 应用的关键。本研究通过考察保留时间比值和保留时间差2 种参数在不同品牌仪器、不同规格色谱柱中的重现性。保留时间差的波动较为明显，RSD 在1.62%～5.10%之间，相对保留时间波动较小（RSD＜2.0%），为保证色谱峰的准确定位，结合DAD 检测器采集到3D 谱图，比对样品中各测定成分与相应对照品的光谱图，以验证待测成分定位，操作快捷且能够准确定位待测化合物，为以后研究多成分分析方法的建立提供了新途径。

3.3 内标化合物的选择白芍化学成分主要为挥发油类、单萜类、三萜类及黄酮类化合物等，其质量控制一般以主要成分芍药苷指示成分［15-17］。芍药苷在白芍中含量达20～30 mg/g，且芍药苷化学性质稳定，容易取得，故选其作为内参物，选用芍药苷定量分析时没食子酸、儿茶素、芍药苷内酯、1，2，3，4，6-五没食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍药苷的相对校正因子稳定，定量准确RSD小于2.0%。

3.4 相对校正因子的确定本实验在仪器、色谱柱、柱温、流速、pH 值及实验人员较小变动时，考察了其对相对校正因子的影响程度，结果各待测成分的相对校正因子在测定条件变化小的情况下影响较小，RSD 值均＜1%，按照《一测多评法建立的技术指南》中要求在综合考虑影响相对校正因子的各种影响因素，在RSD小于5%的情况下，取其平均值作为相对校正因子［4］，因此，选择各测定条件下的相对校正因子的均值作为最终“一测多评”方法的相对校正因子，通过对不同来源25 批次白芍样品的测定对“一测多评”法和外标法所得结果进行配对t检验分析，结果显示两种方法所得白芍药材6 种含量不存在显著差异（P＞0.01），且没食子酸、儿茶素、苯甲酰芍药苷含量相关性为1，表明“一测多评”法用于白芍中6 种成分的含量测定具有良好的准确性，该法操作简便快速、准确可靠，可以应用到白芍药材及配方颗粒的含量测定以达到绿色、环保、节约成本，多指标质量控制的目的。