温肾化痰方对动脉粥样硬化模型大鼠主动脉血管平滑肌细胞凋亡及细胞内胆固醇酯的影响∗

巫燕慧，林海丹，陈英男，张 忠△，黄若兰

1 深圳市盐田区人民医院/南方科技大学盐田医院，深圳 518000；2 广州中医药大学深圳市中医院；3 深圳大学总医院

动脉粥样硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）是全球范围内人类死亡的主要原因，世界卫生组织预测，到2020年心血管疾病将成为全世界第一死因［1］。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是ASCVD 最基本的病理改变，是由大量脂质沉积在动脉管壁形成脂肪条纹而后逐渐发展成粥样斑块并引发多种并发症的慢性动脉疾病［2］。研究认为AS既是一种慢性炎症性疾病，又是一种脂质代谢紊乱造成的疾病［3］。细胞脂质代谢中胆固醇的代谢失衡可促进AS 的发生及进展［4］，而血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的凋亡则导致细胞外基质（覆盖斑块的纤维帽的主要成分）分泌减少，使斑块纤维帽变薄、降解，加剧斑块不稳定，甚至发生破裂［5-6］，从而导致发生不良心血管事件（cardiovascular events，CVE）。

温肾化痰方由广东省名中医罗陆一教授在二仙汤基础上化裁而成，由仙茅、淫羊藿、石菖蒲、瓜蒌皮、乳香组成。前期研究发现该方具有降低小鼠低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）含量，下调主动脉平滑肌细胞Orail、Caspase 3、Caspase 9、Bax 基因及蛋白表达，上调Bcl-2基因及蛋白表达作用［7］。本实验通过检测不同浓度温肾化痰方对氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）诱导的大鼠主动脉血管平滑肌细胞凋亡及细胞内胆固醇酯含量的影响，为温肾化痰方防治AS提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物60只6 周龄健康雄性Wistar 大鼠，SPF级，体质量（250±10）g，购自广东省医学实验动物中心三水基地（批号：44411600003988），实验动物合格证号：SCXK（粤）2014-0035。本实验在广州中医药大学实验动物中心SPF 实验室进行。饲养条件为每日光照12 h、黑暗12 h，循环进行，饮食、饮水不受限制。本实验通过广州中医药大学医学实验动物伦理委员会审查。

1.2 主要试剂与仪器平滑肌细胞培养基（smooth muscle cell medium，SMCM）培养液（美国Gibco，批号：1427263）；胎牛血清（美国Gibco，批号：1414426）；二甲基亚砜DMSO（德国默克SIGMA-ALDRICH，批号：Lot SHBB3758V）；Formazan溶解液DMSO（北京索莱宝M1020，批号：Lot NO20180312 SHBB3758V）；Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒（Beyotime C1062M，批号：111117180621）；总胆固醇检测试剂盒（南京建成A111-1）；游离胆固醇检测试剂盒（上海索莱宝BC1895）；恒温细胞培养箱（Thermo HERAcell 150i）；倒置生物显微镜（OPTEC BDS200-PH）；解剖镜（广州明美光电技术有限公司）；荧光显微镜（广州明美光电技术有限公司）；酶标仪（Thermo Multiskan Mk3）；TDL-80-2B 型低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂飞鸽）；WD-9405B 型水平摇床（北京六一生物科技有限公司）；SW-CJ-1FD型无菌超净台（苏洁净化）；96孔板（美国Corning）；中药煎煮机（北京东华原医疗设备厂YFY2020000mL）；LABOROTA4000 型旋转蒸发仪（德国Heidolph 公司）；K2800 型微量分光光度计（北京凯奥科技有限公司）。

1.3 含药血清制备

1.3.1 中药制备 温肾化痰方药物组成：仙茅10 g，淫羊藿10 g，石菖蒲15 g，瓜蒌皮15 g，乳香15 g（由广州中医药大学第一附属医院中药房提供）。制备：煎药前先将饮片制成粗粉，按比例取以上药物加8 倍量水浸泡30 min，加热煮沸后再煎煮30 min 取汁；第二煎加5 倍量水直接加热，煮沸后煎煮30 min 取汁：合并2 次药液，以4 层棉纱布过滤。将滤液用旋转蒸发仪（蒸发温度≤60℃）浓缩成含生药0.5265 g/mL 的药液，常温冷却后，置于4℃冰箱内保存使用。

1.3.2 取血清时间筛选 以中剂量温肾化痰方提取液（10.053 g/kg，相当于70 kg 成人等效剂量2 倍［8］）灌胃给药，灌胃容量为每次0.5 mL，每日2次，连续5天。第5天灌胃结束后0.5、1、2、3、4 h，每个时间点每组取2 只大鼠麻醉并固定，腹主动脉取血，4℃，离心半径13.5 cm，13000 r/min 离心10 min，分离出上清液，经0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌后用高效液相色谱法测定温肾化痰方有效成分挥发油类、三萜类、黄酮类含量，比较不同时间点的结果差异，筛选出温肾化痰方含药血清的最佳取材时间为3 h。

1.3.3 含药血清制备及分组 采用随机数字表法将32 只Wistar 大鼠分为空白组及低、中、高剂量中药组，每组8 只。低、中、高剂量中药组分别按照5.256、10.053、20.106 g/（kg·d）温肾化痰方提取液（给药量相当于70 kg 成人等效剂量1、2、4倍［8］）灌胃给药，每次0.5 mL，每日2 次，空白组灌胃等剂量生理盐水，连续5天。第5天灌胃结束3 h后麻醉大鼠并固定，腹主动脉取血，分离上清液，经0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌后，储存于-80℃冰箱备用。

1.4 干预方法

1.4.1 大鼠主动脉平滑肌细胞分离 处死Wistar大鼠，分离、冲洗、裁剪备用。将小组织块种于25 cm2培养瓶底，加入SMCM 培养基（含双抗、FBS、平滑肌细胞生长补充物）1 mL，置于5%CO2、37℃饱和湿度培养箱内孵育约3～5 h，当组织块自然黏附于瓶壁后把培养瓶放平，使组织块完全浸入到培养液中，继续置于培养箱内培养，每隔3 天更换培养基，组织块周围的细胞生长至70%时（16～20天）即可传代。吸去旧培养基，0.01 mol/L PBS 清洗，加入2.5 g/L 胰蛋白酶消化液，室温下消化约2 min，加入SMCM 培养基终止消化，离心、去上清、重悬细胞，处理后置光学显微镜下观察：蓝色细胞为异常或死亡细胞，活细胞不着色，并行计数后传代培养，每隔2 天换液1 次，待细胞融合成致密单层后可再次传代。取培养的P2 代细胞，以每孔2×105个细胞接种于内置有盖玻片的24孔板中培养，24 h 后待细胞自然贴壁、生长良好时，取出盖玻片，冲洗、孵化，复染核10 min，在荧光显微镜下观察并进行血管平滑肌细胞鉴定。将鉴定合格的血管平滑肌细胞接种到6 孔培养板中，置5%CO2、37℃孵箱培养2 h 后去上清液，洗去未贴壁细胞，继续培养3天后随机分组。

1.4.2 分组 分离的主动脉平滑肌细胞继续在6 孔培养板培养第3 天后分为：1）正常组：10%Gibco 血 清；2）对 照 组：ox-LDL 70 mg/L［9］+10%Gibco 血清；3）低剂量中药组：ox-LDL 70 mg/L+低剂量中药含药血清；4）中剂量中药组：ox-LDL 70mg/L+中剂量中药含药血清；5）高剂量中药组：ox-LDL 70 mg/L+高剂量中药含药血清。所有分组加入血清后均作用于细胞12 h。

1.5 观察指标

1.5.1 主动脉平滑肌细胞存活率 细胞培养第3 天，药物处理后96 孔板每孔加入10 μL MTT 溶液，细胞培养箱内孵育4 h。每孔加入100 μL Formanzan 溶解液，细胞培养箱内继续孵育，直至在普通光学显微镜下观察发现Formanzan 全部溶解。37℃孵育4 h左右，紫色结晶全部溶解。用酶标仪在492 nm 处测定吸光度。计算细胞存活率。实验重复3 次，每次每组设4～5 个复孔。细胞存活率（%）=处理组OD值/对照组OD值×100%。

1.5.2 主动脉平滑肌细胞凋亡水平 1）将贴壁细胞用0.25%的胰酶消化，于室温离心半径13.5 cm，2000 r/min离心5～10 min，收集细胞，用去离子水将10×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer，用预冷1×PBS（4℃）重悬细胞1次，离心半径13.5cm，2000 r/min 离心5～10 min，洗 涤 细胞；2）加入300 μL的1×Binding Buffer悬浮细胞，加入5 μL的Annexin V-FITC 混匀后避光，室温孵育15 min进行标记；3）上机前5 min再加入5 μL PI染色，用流式细胞仪检测，激发波长Ex 为488 nm，发射波长Em 为530 nm，Annexin V 绿色荧光通过FITC 通道（FL1）检测，PI 红色荧光通过PI通道（FL2或FL3）检测，进行荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置；4）以FITC和PI荧光作双参数点图，以Annexin V FITC 为横轴，PI 为纵轴，将细胞分为4 个区，1 区：机械损伤细胞（Annexin V FITC-/PI+）；2区：凋亡晚期或坏死细胞（Annexin V FITC+/PI+）；3区：存活细胞（Annexin V FITC-/PI-）；4 区：早期凋亡细胞（Annexin V FITC+/PI-）。实验重复3次。

1.5.3 主动脉平滑肌细胞内胆固醇酯水平 收集各组细胞，PBS 洗涤3 次，重悬于0.5 mL 磷酸钠缓冲液（pH 7.4，0.1 mol/L）中，超声波裂解细胞取上清液，微量分光光度计检测TC 和游离胆固醇（free cholesterol，FC）浓度。以考马斯亮蓝G-250 法测定各组细胞样品中蛋白质含量，细胞内总胆固醇含量用每毫克蛋白所含胆固醇含量表示，反应液中省去胆固醇酯酶用以检测游离胆固醇。细胞内胆固醇酯（cholesteryl ester，CE）=TC-FC。

1.6 统计学方法采用SPSS 20.0 软件分析数据，计量数据以±s表示，两组间比较采用非配对t检验，多组比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 主动脉平滑肌细胞存活率与正常组比较，对照组主动脉平滑肌细胞存活率下降（P＜0.01）。与对照组比较，低、中、高剂量中药组主动脉平滑肌细胞存活率增加（P＜0.01）。与低剂量中药组比较，中、高剂量中药组主动脉平滑肌细胞存活率增加（P＜0.01）。与中剂量中药组比较，高剂量中药组细胞主动脉平滑肌细胞存活率增加（P＜0.01）。见表1。

表1 各组主动脉平滑肌细胞存活率比较（±s） %

表1 各组主动脉平滑肌细胞存活率比较（±s） %

注：*表示与正常组比较，P＜0.01；△表示与对照组比较，P＜0.01；▲表示与低剂量中药组比较，P＜0.01；○表示与中剂量中药组比较，P＜0.01

组别正常组对照组低剂量中药组中剂量中药组高剂量中药组第1次实验107.45±0.55 44.87±0.38 60.27±0.43 84.33±0.44 91.79±0.44第2次实验108.05±0.51 45.04±0.46 60.70±0.50 83.88±0.34 92.49±0.51第3次实验108.45±0.51 45.63±0.44 61.08±0.29 85.39±0.43 93.33±0.53平均值107.98±0.69 45.18±0.56*60.68±0.55△84.53±0.78△▲92.54±0.83△▲○

2.2 主动脉平滑肌细胞凋亡水平正常组、对照组及低、中、高剂量中药组主动脉血管平滑肌细胞凋亡率分别为（5.42±0.05）%、（39.51±0.44）%、（29.67±0.18）%、（20.44±0.50）%、（8.01±0.20）%。与正常组比较，对照组主动脉平滑肌细胞凋亡水平升高（P＜0.01）。与对照组比较，低、中、高剂量中药组主动脉平滑肌细胞凋亡水平均下降（P＜0.01）。与低剂量中药组比较，中、高剂量中药组主动脉平滑肌细胞凋亡水平下降（P＜0.01）。与中剂量中药组比较，高剂量中药组主动脉平滑肌细胞凋亡水平下降（P＜0.01）。见图1。

图1 各组大鼠主动脉血管平滑肌细胞凋亡率比较

2.3 主动脉平滑肌细胞内胆固醇酯与正常组比较，对照组TC 及CE 水平升高（P＜0.01）。与对照组比较，低、中、高剂量中药组细胞内TC及CE水平降低（P＜0.01）。与低剂量中药组比较，中、高剂量中药组细胞内TC 及CE 水平降低（P＜0.01）。与中剂量中药组比较，高剂量中药组细胞内TC 及CE水平降低（P＜0.01）。各给药组FC比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠细胞内胆固醇酯比较（±s）

表2 各组大鼠细胞内胆固醇酯比较（±s）

注：*表示与正常组比较，P＜0.01；△表示与对照组比较，P＜0.01；▲表示与低剂量中药组比较，P＜0.01；○表示与中剂量中药组比较，P＜0.01

组别正常组对照组低剂量中药组中剂量中药组高剂量中药组TC（mmol/L）0.25±0.02 0.89±0.04*0.68±0.08△0.51±0.07△▲0.40±0.07△▲○FC（μmol/L）56.32±0.38 60.83±0.26 59.32±0.14 58.35±0.34 57.49±0.23 CE（mg/L）22.05±2.13 107.87±5.82*75.75±10.07△51.89±7.69△▲42.51±9.03△▲○

3 讨论

中医学无ASCVD 病名，根据其症状属“胸痹”“心痛”范畴。《素问·五藏生成篇》载：“心之合脉也，其荣色也，其主肾也”，肾阳为一身阳气之根本，心阳依赖于肾阳之温煦。因肾阳虚衰，气化失职，致水液输布运化失常，聚湿成痰，痰阻心胸；肾阳虚损，无力温煦心阳，使心气推动血液运行无力，血脉运行缓慢，瘀阻于心脉［10］。中医药治疗AS 疗效较好，涉及调节脂质代谢、抗氧化、抗炎、保护血管内皮细胞、稳定斑块等机制［11-12］。

温肾化痰方由仙茅、淫羊藿、石菖蒲、瓜蒌皮、乳香组成。方中仙茅、淫羊藿为君药，仙茅温阳补肾，强筋骨，通经脉；淫羊藿性辛、甘、温，归肝、肾经；石菖蒲辛温，开窍豁痰，配合瓜蒌皮宽胸理气开痰结，消痰散结以治其标；乳香性温，味辛善行，能行血分瘀滞，开经络壅滞，并载诸药直达病所，为引经佐使药。全方温补、消痰并用，以温肾助阳为主，活血化痰为辅。对胸痹心肾阳虚患者单纯使用活血化瘀药疗效不足，而以温肾为本、化痰散瘀药为辅的温肾化痰方，方中有补有泻，用于冠状动脉粥样硬化性疾病，有一定依据［7，13］。

AS 是以血管内皮损伤和血管平滑肌细胞移行增殖为基础的病变，其中血管平滑肌细胞的增殖和凋亡对AS 的发生、发展起重要作用［14］。正常生理状态下，血管平滑肌细胞增殖与凋亡维持相对平衡状态。当机体处于氧化应激等条件下，沉积于大中动脉内膜下的LDL 容易发生氧化修饰，形成ox-LDL［15］，从而促进血管平滑肌细胞凋亡、转化成泡沫细胞，促进血栓形成，同时诱导产生基质金属蛋白酶，促进AS斑块的不稳定性［16-17］，也可促进LOX-1 的表达，导致血管平滑肌细胞发生凋亡，加重斑块不稳定性，从而导致斑块破裂［18］。温肾化痰方可减少血管平滑肌细胞凋亡，保持其稳定的存活率，进而使血管平滑肌细胞增殖与凋亡维持在平衡状态，延缓AS的进展。

高脂血症是AS 发病的一个重要危险因素［19］。早期血液中单核细胞在血管平滑肌细胞功能受损时迁移至内皮，分化成巨噬细胞，摄入大量脂质，各种因素作用下大量胆固醇酯聚积至细胞转化成泡沫细胞，而泡沫细胞是AS 斑块形成脂质条纹的特征性标志，泡沫细胞内的脂滴存在的主要脂质是胆固醇，故胆固醇代谢平衡在AS 发生和发展过程中发挥重要作用［20］。温肾化痰方可降低主动脉平滑肌细胞内总胆固醇及胆固醇酯含量，减少细胞泡沫化，从而延缓AS 进程，且在一定剂量范围内，随着浓度的增加，其作用效果也增加。

本研究用中药血清药理学方法，证明温肾化痰方可有效减少ox-LDL 诱导的大鼠主动脉血管平滑肌细胞凋亡，有效抑制血管平滑肌细胞凋亡，保护血管平滑肌细胞，减轻主动脉血管重构，同时减少细胞内总胆固醇及胆固醇酯含量，减少泡沫细胞形成，从而延缓AS 发生发展。课题组未来将通过检测相关炎性因子及mRNA 表达进一步探讨其作用机制。