基于网络药理学预测穿心莲内酯抗呼吸道感染的分子作用机制

黄康勤

广西河池大化县人民医院，广西 河池 530800

呼吸道感染（respiratory tract infection，RTI）是指由于各种原因导致病原体如细菌、病毒、真菌和寄生虫等侵袭人体呼吸道引起的感染，临床症见流涕、咳嗽、头痛、咽痛、发热、乏力、肢体酸痛［1］等，是临床常见的呼吸系统疾病，全年皆可发病。该病发病率高，人群普遍易染，而且呼吸道感染未及时得到治疗可引发中耳炎、支气管炎、肺炎，甚至败血症、肾炎、病毒性心肌炎等全身炎症症状［2］。目前主要以对症处理为主，予抗病毒药物联合抗菌药物治疗，但抗生素选择的针对性较差，且随着抗生素长期广泛应用，耐药菌株不断增多，加之抗生素毒副作用相对较大，因此从天然产物尤其是从中药中分离筛选有效抗菌组分成为抗菌药物研发领域的研究方向之一。穿心莲内酯是从穿心莲Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees中分离出的二萜内酯，具有抗炎、抗肿瘤和免疫调节等作用［3］，能抗人体呼吸系统感染，被誉为“天然抗生素”［4］，其潜在机制仍有待研究。

近年来网络药理学的迅速发展为中医药的研究带来了契机，给中药复杂成分研究提供了简便方法。网络药理学是通过整体性研究药物、靶点、基因、疾病相互之间的网络关系，综合观察和揭示药物协同干预与影响疾病的作用机制，与中医整体观念相似［5］，本研究采用网络药理学方法系统探讨穿心莲内酯抗呼吸道感染的分子作用机制。

1 方法与思路

1.1 穿心莲内酯相关信息及作用靶标预测穿心莲是一种传统用作抗炎和抗菌的药用植物，穿心莲内酯是穿心莲的主要活性成分，具有多种药理活性，包括抗炎、抗癌、抗肥胖、抗糖尿病和其他活性［6］。穿心莲内酯属于二萜内酯类成分，这些化合物含有γ-丁内酯部分，该部分由含有四个碳原子和一个氧原子的脂肪族五元环组成，并在氧原子附近的碳上带有酮基，其化学结构2D 平面结构和3D 分子结构模型见图1。本研究从Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数 据库下载穿心莲内酯的化学结构，通过PubMed（http：//kns. cnki. net）、DrugBank（https：//www.drugbank.ca）、Swiss Target Prediction（http：//www. swisstargetprediction. ch/）和BATMAN（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php）数据库查找穿心莲内酯的作用靶标，再经过Uniprot（https：//www.uniprot.org/）数据库逐一核查是否为人源性靶点并更正基因名。

图1 穿心莲内酯化学结构

1.2 呼吸道感染相关信息及作用靶标预测呼吸系统感染是人体常见病和多发病，主要以细菌和病毒感染为主。在一些情况下，病毒感染导致宿主细胞裂解，数百万拷贝的病毒被释放，这影响了细胞存活所需的能量平衡，不平衡的能量产生与消耗导致细胞凋亡。一些慢性感染可导致管家基因和细胞蛋白质的表达改变，从而将其转化为癌细胞或使免疫系统过度活化［7］，在该过程中会引起机体的一系列复杂的生物过程。

CTD 是一个强大的公开数据库，它提供关于化学-基因/蛋白质相互作用、化学-疾病和基因-疾病关系的人工精选信息。这些数据与功能和途径数据相结合，有助于发展关于环境影响疾病潜在机制的假设，旨在促进对环境暴露如何影响人类健康的理解。

本研究从CTD、Genecards和DIGSEE数据库中查找关于呼吸道感染的基因靶点，以“Respiratory Tract Infection”为检索式，下载数据库中与呼吸道感染有关的基因靶点，合并去重，并核查是否为人源性靶点，并校对基因名。

1.3 穿心莲内酯作用于呼吸道感染的靶点蛋白相互作用分析将穿心莲内酯作用靶标与呼吸道感染有关的基因靶点进行交集，得到重叠靶点，认为这些重叠靶点是穿心莲内酯对呼吸道感染的潜在作用靶点。将潜在作用靶点信息提交至STRING（https：//string-db.org/）数据库中进行蛋白互作（Protein-Protein Interaction，PPI）分析，选择“Homo sapiens”人类为研究机体，设置中度交互分数为0.4，得到潜在作用靶蛋白的PPI 网络。借助Cytoscape 软件插件“Network Analyzer”进行拓扑属性分析，综合预测相关性较大的关键作用靶点。

1.4 穿心莲内酯对呼吸道感染的潜在作用靶点的生物信息学分析利用Cytoscape 软件中的插件“Clue GO”对潜在作用靶点进行生物学过程（Biological Process）分析和KEGG 信号通路富集分析。将靶点信息提交至Clue GO，选择分析基因本体GO-生物学过程，研究条件选择数据来源于实验数据［All_Experimental_（EXP，IDA，IPl，IMP，IGI，IEP）］，限定P值＜0.01，得到生物学过程数据。勾选KEGG分析，校正P值＜0.05，得到富集的信号通路。

1.5 分子对接反向验证穿心莲内酯与潜在作用靶点的结合性采用IGEMDOCK 软件进行分子对接，IGEMDOCK 软件分子对接原理是基于对接位点（即蛋白质-配体相互作用）和化合物性质（即原子组成）使用k-均值和分层聚类方法提供后分析工具［8］，软件提供交互式界面，以制备靶蛋白结合位点和筛选复合物库［9］。从PDB 数据库获取受体信息即作用靶蛋白信息，下载并保存为PDB 格式；从Pubchem 下载配体即穿心莲内酯3D 构象的SDF 格式，同时转变为MOL 格式，将受体蛋白和化合物分子信息输入软件后选择标准对接，其他默认设置，得到分子对接结果。

2 结果

2.1 穿心莲内酯的作用靶点根据PubMed、DrugBank、Swiss Target Prediction 和BATMAN数据库，以及文献检索查找到穿心莲内酯的作用靶标122 个，包括肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、缺氧诱导因子1 亚单位α（HIF1α）等，穿心莲内酯作用靶点的相互作用网络见图2，根据作用靶点的度值进行排序，由蓝色向紫色渐变，颜色越深表示靶点度值越大，两个靶点之间的连线粗细体现两个靶点间交互值大小，线条越粗交互值越大。由网络图可见TP53、IL-6、CASP3、MAPK3和TNF是度值较大的靶点。

图2 穿心莲内酯作用靶点的蛋白互作网络图

2.2 穿心莲内酯作用于呼吸道感染的潜在作用靶点以呼吸道感染“Respiratory Tract Infection”为检索式在CTD 数据库、Genecards 数据库和DIGSEE 数据库中查找关于呼吸道感染的基因靶点，其中在CTD数据库和Genecards数据库检索到的靶点中，仅根据作用靶点与呼吸道感染的相关度评分函数各取前300个代表性靶点，3个数据库搜集到的靶点合并去重后获得677 个与呼吸道感染相关的靶点。通过VENNY 2.1 在线分析服务器将穿心莲内酯作用靶标与呼吸道感染相关的靶点交集，得到35 个交集靶点，包含BCL2 凋亡调节剂（BCL2）、血红素氧合酶1（HMOX1）、肿瘤蛋白p53（TP53）、基质金属肽酶9（MMP9）等。

2.3 潜在作用靶点的蛋白互作网络构建及拓扑属性分析将35 个交集靶点信息导入STRING 数据库进行蛋白互作分析，利用Cytoscape 软件将结果进行可视化分析，交集靶点蛋白互作网络图见图3，并对交集靶点蛋白进行拓扑属性分析，见表1。通过计算分析，发现该网络平均度值约15.1，平均介数中心性约22.5，平均中心接近度约0.02，如果某个节点在网络中具有较高的度数和介数中心性可能意味这个节点在整个网络中具有重要作用，结合网络图及拓扑属性表发现度值和介数中心性均大于均值的节点有8 个，分别是IL6、TP53、TNF、CASP3、SRC、MAPK3、MMP9 和IL1B，说明这8 个靶蛋白可能是穿心莲内酯作用于呼吸道感染的重要作用靶点。

表1 潜在作用靶点的拓扑属性

图3 穿心莲内酯潜在作用靶点蛋白互作网络图

2.4 穿心莲内酯潜在作用靶点的生物学过程分析经Cytoscape 软件插件—Clue GO 进行生物学过程分析，得到112 个条目，包括活性氧代谢过程、对白细胞介素1 的反应、调节激素代谢过程、内源性凋亡信号通路的负调节、半胱氨酸型内肽酶活性的负性调节、细胞对抗生素的反应、调节环化酶活性、细胞对氧化应激的反应等，见图4—5，按照属性可大致分为12个集群。

图4 穿心莲内酯潜在作用靶点的生物学过程分析

图5 穿心莲内酯潜在作用靶点的生物学过程分析

2.5 穿心莲内酯潜在作用靶点的信号通路分析经Clue GO 对潜在作用靶点进行富集分析，校正P值＜0.05 得到包括NF-κB 信号通路、炎症性肠病（IBD）、p53 信号通路、ErbB 信号通路、TRP通道的炎症介质调节、甲状腺激素信号通路、GnRH信号通路等95条信号通路，通路信息见表2。

表2 穿心莲内酯潜在作用靶点富集的信号通路

2.6 穿心莲内酯与潜在作用靶点的结合性通过IGEMDOCK 软件进行分子对接，得到分子对接评分函数。由于IGEMDOCK 软件采用的是经验打分函数，其经验评分函数估计是使用“结合能=范德华力+氢键”公式计算得到［10］，化合物分子与受体结合作用可能性越大，则两者间结合能量越低，结合更稳定。穿心莲内酯与潜在作用靶蛋白靶点结合能平均值在-93.0kcal/mol 以上，预测出结合最稳定的是TNF与穿心莲内酯的结合。见表3。

表3 分子对接结果

3 讨论

穿心莲内酯具有广泛的生物活性，如抗炎、抗过敏、抗血小板聚集、抗艾滋病毒等［11］，临床多用于治疗感冒、咽喉痛、流感及呼吸系统感染。本研究通过大数据信息筛查穿心莲内酯的作用靶点与呼吸道感染相关的发病靶点，预测有35 个靶点是穿心莲内酯抗呼吸道感染的潜在靶点，包括MAPK3、MMP9、BCL2、HMOX1、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（CDKN2A）、丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）等；通过对潜在作用靶点进行蛋白互作分析，得到8 个靶点（IL6、TP53、TNF、CASP3、SRC、MAPK3、MMP9 和IL1B）是较重要的潜在作用靶点。MMPs（基质金属肽酶）是一类依赖Zn2+和Ca2+的超家族成员，可降解的细胞外基质蛋白酶在维持细胞外基质的稳定性方面有重要意义，而在炎症性疾病中MMPs 发挥溶解细胞外基质和破坏基膜的作用，MMP9 参与了炎症、血管形成和肿瘤侵袭转移等病理生理过程［12］，有研究表明穿心莲内酯可通过NF-κB p65 亚基的核移位和iκb 磷酸化、降低MMP-9 的表达和活性发挥抗肺癌作用［13］。HMOX1（血红素加氧酶1，HO-1）是参与血红素降解的一种酶，在血红素降解的发病机制中起重要作用［14］，具有抗炎和抗氧化作用，可调节宿主先天性和适应性免疫应答，以响应败血症、移植和自身免疫反应，并防止与炎症相关的氧化损伤［15］，有体外数据表明HO-1 诱导可以调节细胞，特别是气道上皮细胞对hRSV（呼吸道合胞病毒）感染的易感性［16］，LU等［17］实验发现穿心莲内酯部分地通过抑制NADPH氧化酶活化，诱导HO-1 和GCLM（谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基）表达以减弱TNF-α诱导的ICAM-1表达；SRC 蛋白酪氨酸激酶被认为是许多细胞过程中的重要信号传递者，如生长、基因转录、黏附和凋亡，SRC 在介导TNF-α诱导的ICAM-1 磷酸化中发挥重要作用，这对多核白细胞黏附至关重要，而穿心莲内酯可抑制TNF-α诱导的SRC 磷酸化。推测穿心莲内酯通过调控相关基因的表达与否，可进一步干预疾病的发生发展，并且这些实验研究也反向证明预测的穿心莲内酯作用靶点具有一定准确性。

对穿心莲内酯的作用靶点进行生物学过程分析和信号通路富集分析，得出这些靶点参与112种生物学过程，涉及活性氧代谢过程、对IL-1 的反应、调节激素代谢过程、细胞对氧化应激的反应、内源性凋亡信号通路的负调节、半胱氨酸型内肽酶活性的负性调节等，富集出95 条信号通路，如NF-κB 信号通路、炎症性肠病（IBD）、p53 信号通路、ErbB 信号通路、TRP 通道的炎症介质调节等。查阅文献发现穿心莲内酯治疗呼吸道感染与NF-κB信号通路有密切关系，DING 等［18］在研究穿心莲内酯在流感病毒感染的小鼠体内的抗流感活性，其机制研究表明穿心莲内酯的活性与NF-κB和jak-stat信号通路有关，穿心莲内酯可通过抑制NF-κB p65的磷酸化水平减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤［19］。LEE 等［20］探究了穿心莲内酯对小鼠过敏原诱导的气道炎症的机制，发现穿心莲内酯可以抑制stat3 介导的NF-κB 通路，在lps（脂多糖）刺激的raw264.7 巨噬细胞中发挥抗炎作用，能降低气道炎症反应。其他通路如p53 信号通路、ErbB 信号通路、癌症信号通路、炎症性肠病（IBD）通路等也有相关性，但穿心莲内酯通过干预这些信号通路来调控呼吸道感染的文献报道较少，因此后期有必要通过实验验证这些信号通路。此外无论是生物学过程还是信号通路都是多个基因靶点共同参与或调控，映射了中医药多成分、多靶点、多途径的特点。通过分子对接技术反向验证穿心莲内酯与预测到的作用靶点之间的结合性良好，表明基于大数据的筛选与预测具有一定准确性。

本研究运用网络药理学方法系统探究穿心莲内酯抗呼吸道感染的效应机制，科学收集和预测穿心莲内酯的有效化学成分和作用靶点，从药物、基因、靶点、疾病网状关系探究四者之间的联系，由于本研究是基于大数据的筛选和预测，具有一定局限性，后期仍需真实世界进行验证。